为大家分享一篇发表在Anal. Chem.的文章，Distinguishing Histidine Tautomers in Proteins Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry^[1]。该文章的通讯作者是来自马萨诸塞大学阿默斯特分校的Richard W. Vachet教授。

组氨酸是人体蛋白质结构中的重要组成氨基酸。研究发现，组氨酸具有N^δ-H和N^ε-H两种互变异构体，通过两种互变异构体的转换，可以在蛋白质中介导质子转移。目前常使用2D NMR技术进行区分，但操作相对繁复。共价标记质谱是一种研究蛋白质结构的有力方法，具有操作简单，灵敏度高，结构分辨率高等优点。在本文中，作者尝试以焦碳酸二乙酯（DEPC）为标记试剂，采用共价标记质谱区分组氨酸互变异构体。

组氨酸侧链的咪唑上具有两个氮原子，其中一个氮上的孤电子对参与芳香环π键的组成，而另一个氮原子仍保留孤对电子，更容易与DEPC等亲电子试剂反应。而组氨酸的两个互变异构体中都只有一个保留孤对电子的氮原子，且该氮原子位置不同，N^δ-H互变异构体中的N^ε2与DEPC反应，而N^ε-H互变异构体中的为N^δ1。因此以DEPC标记组氨酸以区分两个互变异构体的方法是可行的（图1）。

为了测试DEPC标记区分两种互变异构体的能力，作者以几种含组氨酸的肽，在确保DEPC仅标记组氨酸条件下进行实验。以Fmoc-DGHGG-NH₂为例子，该肽在N端包括一个Fmoc基团以确保仅标记组氨酸。采用等度洗脱来最大限度地利用LC分离两种异构体，并确保流动相组成不影响肽段电离效率，从而可以更好地量化每个互变异构体的比率。结果发现，在11.4和13.6分钟洗脱的峰具有相同的m/z值（图2）。根据串联MS数据，发现这两个峰代表着组氨酸上成功标记DEPC的单一物质（图3）。并且，这些同量异位离子的串联质谱不同，表明这两种物质为带有不同组氨酸互变异构体的物质。作者将先洗脱出的物质命名为修饰物质1，后洗脱出的为修饰物质2。根据MS/MS数据，两者的主要区别为修饰物质2具有更加丰富的羧基化a₃离子（a₃^*）。

此外，在重复实验中，作者发现物质2与物质1的丰度比为3.9±0.2。而研究发现，在中性pH条件下，游离氨基酸N^ε-H互变异构体与N^δ-H互变异构体的比接近于4:1。因此，两物质的峰面积比表明物质1可能为N^δ-H互变异构体，而物质2可能为N^ε-H互变异构体。

结合以上发现，并考虑肽解离途径等因素，作者对两物质质谱图谱差异做出推测。当物质2为N^ε-H互变异构体侧链时，DEPC标记在N^δ1上，有利于肽通过b_x-y_z途径解离，随后通过b_x-a_x途径损失CO，因此物质2富含a₃^*离子。当物质1为N^δ-H互变异构体时，DEPC标记在N^ε2上，肽通过组氨酸途径解离，并形成了稳定五元环，因此优先形成更稳定的b₃^*离子（图4）。以上发现进一步证明了Fmoc-DGHGG-NH₂中物质1为N^δ-H互变异构体，物质2为 N^ε-H 互变异构体。根据丰度比以及肽解离途径不同，作者在其他模型肽标记实验中也成功区分两互变异构体。由于组氨酸的pKa在一定程度上会影响互变异构体的比例，因此两互变异构体的丰度比可能会略有变化。总之，以上结果表明，DEPC共价标记质谱可以识别两个组氨酸互变异构体。

总而言之，作者成功使用DEPC共价标记质谱区分肽与蛋白质中的组氨酸互变异构体，利用丰度比与洗脱时间，以及CID期间的肽解离模式，区分两种互变异构体。利用该方法，作者团队已经确定了几种蛋白质组氨酸互变异构体比率，并且相对于2D NMR方法，该方法更简单、更快、更精确，有利于探索蛋白质中组氨酸残基周围的局部结构，提供高分辨率的结构信息。

撰稿：孙燕萍

编辑：李惠琳

原文：Distinguishing Histidine Tautomers in Proteins Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry.