今天给大家介绍课题组2022年10月发表在Analytical Chemistry上的文章，题目是Bisulfite-free and single-base resolution detection of epigenetic DNA modification of 5-methylcytosine by methyltransferase-directed labelling with APOBEC3A deamination sequencing。熊军和陈可可为论文第一作者和共同第一作者。

DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶，5mC）是哺乳动物DNA中最普遍的表观遗传修饰，5mC在调控胚胎发育、X-染色体失活和肿瘤发生方面发挥着非常重要的作用，甲基化图谱局部和整体的改变与不同的细胞和病理过程相关。在哺乳动物的基因组中，5mC主要存在于CG二核苷酸中，由DNA甲基转移酶（DNMTs）以S-腺苷-L甲硫氨酸（SAM）为甲基供体催化生成。在哺乳动物基因组中，大约70-80%的CG是甲基化的。5mC的准确检测对疾病的诊断具有深远的意义。

5mC的定位分析方法中，甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq）和甲基CpG结合域测序(MBD-seq）无法以单碱基分辨率检测5mC，基于限制性酶的方法（如MRE-seq和Methyl-MAPS）能够对5mC进行单碱基分辨率分析，但其序列依赖性强，假阳性率高。亚硫酸氢盐测序（BS-seq）已被广泛用于5mC图谱分析。然而，由于反应条件苛刻，亚硫酸氢盐处理能够导致高达99.9%的DNA被降解。此外，还有人开发了TET辅助的吡啶硼烷测序（TAPS）和酶促脱氨法测序（EM-seq）用于DNA中5mC的检测。这两种方法都基于5mC被TET蛋白氧化为5-羧基胞嘧啶（5caC）的原理，而TET蛋白难以将5mC完全氧化为5caC。

最近，在穿透支原体（Mycoplasma penetrans）中发现了一种CG特异性甲基转移酶M.MpeI。M.MpeI的突变体（M.MpeI-N374K）可以将羧基-S-腺苷-L-甲硫氨酸（caSAM）上的羧甲基转移到CG位点的胞嘧啶5位上，形成5-羧甲基胞嘧啶（5camC）。凭借5camC抵抗胞嘧啶脱氨酶（A3A）的性质，我们提出了一种单碱基分辨率检测5mC的方法，通过甲基转移酶标记与A3A脱氨测序（MLAD-seq）定位DNA中的5mC（图1）。

图1 MLAD-seq用于DNA中5mC定位分析的原理

在MLAD-seq方法中，M.MpeI-N374K甲基转移酶将CG位点上的胞嘧啶羧甲基化，生成5camC，5camC中的羧甲基由于空间位阻大而抑制A3A蛋白的脱氨，因此在测序中读作C。而5mC不会被羧甲基标记，且很容易被A3A蛋白脱氨基，产生与腺嘌呤（A）配对的胸腺嘧啶（T）。因此，在M.MpeI-N374K标记和A3A脱氨后，CG位点的C和5mC分别读作C和T（图1B）。

我们合成了含有CCGG位点的49 bp DNA，首先采用野生型M.MpeI处理该DNA（图2A）。当使用SAM作为甲基供体时，M.MpeI几乎能够完全标记上甲基（>99%标记效率，图2B）。与M.MpeI类似，M.MpeI-N374K也能够以SAM为辅助因子将未修饰的DNA完全甲基化（>99%标记效率，图2B）。当SAM被caSAM替代时，超过91%的DNA在M.MpeI-N374K处理后形成羧甲基化标记，而野生型M.MpeI处理后只有7%的DNA被标记，这表明相比于野生型M.MpeI，M.MpeI-N374K可以更有效地羧甲基化标记CG位点的胞嘧啶（图2B）。

为了最大化胞嘧啶在CG位点的羧甲基化效率，我们优化了羧甲基化反应的条件。我们评估了M.MpeI-N374K浓度对CG位点胞嘧啶羧甲基化效率的影响，结果表明，使用3.2 µM M.MpeI-N374K可获得最佳羧甲基化效率（90%）（图2C）。接下来，我们研究了不同浓度caSAM下的羧甲基化效率，结果表明，随着caSAM浓度的增加，标记产物的比例略有增加（图2D），我们选择320 µM caSAM用于后续羧甲基化反应。对于反应时间的优化，结果表明，标记产物的比率在4 h时达到稳定（图2E）。总之，优化的羧甲基化反应条件为37℃下用3.2 µM M.MpeI-N374K和320 µM caSAM反应4 h。在最优条件下，DNA的CG位点超过91%的胞嘧啶被羧甲基化标记（图2B）。

图2 M.MpeI和M.MpeI-N374K对CG位点胞嘧啶羧甲基化的评估和优化

接下来，我们分析了胞嘧啶的羧甲基化产物5camC。LC-MS/MS结果表明，M.MpeI-N374K羧甲基化后，1.5 min的保留时间出现了一个新的峰，二级质谱结果表明该峰为5camC（图3）。我们接下来评估了A3A蛋白对5mC和5camC的脱氨作用。首先，以caSAM为辅助因子，将DNA经M.MpeI-N374K标记，然后用A3A蛋白脱氨。LC-MS/MS结果表明，在M.MpeI-N374K和A3A处理后，来自5camC水平保持不变（剩余99.9%的5camC，图3C）。然而，在M.MpeI-N374K和A3A处理后，DNA的5mC水平显著降低（仅剩下2.9%的5mC，图3D），表明A3A对5mC的脱氨作用远远强于5camC。这些结果表明， A3A蛋白可以对DNA中5mC高效脱氨，而5camC完全不脱氨。

图3 LC-MS/MS鉴定羧甲基化产物5camC及其脱氨活性验证

根据A3A蛋白对5mC和5camC差异脱氨的思路，我们接下来用Sanger测序评估了MLAD-seq方法的可行性。Sanger结果表明，在M.MpeI-N374K和A3A处理后，5mC修饰取代的DNA（DNA-5mC）中的所有5mC都被读取为T（图4A）。相比之下，同样处理后DNA-C中CG位点的所有C都被读取为C（图4A）。由于M.MpeI-N374K的序列特异性，只有CG位点的C被羧甲基化，非CG序列中的C（如CCGG中的第一个胞嘧啶）也被脱氨基并读作T（图4A）。这些结果表明，在MLAD-seq方法中，CG位点的C和5mC分别被读取为C和T，表明MLAD-seq可以很好地区分DNA中CG位点上的C和5mC。

     接下来，我们通过MLAD seq方法定量评估了单个CG位点的5mC水平。Sanger测序结果表明，TCG、CCG、GCG和ACG中测得的5mC水平与5mC的理论百分比相关性良好（TCG：斜率=0.85，R2=0.96；CCG：斜率=0.95，R2=0.95；GCG：斜率=0.77，R2=0.98；ACG：斜率=0.88，R2=0.95；图4B和4C），表明MLAD-seq方法能够定量检测单个CG位点中的5mC。

图4 利用MLAD-seq定量检测DNA中的5mC

最后，我们应用MLAD seq方法对人基因组DNA中特定位点的5mC水平进行了分析。我们检测了视黄酸受体β（RARB）基因启动子区的5mC水平，该基因是一种已知的肿瘤抑制基因，已有文献表明，RARB基因启动子的高甲基化是预测非小细胞肺癌（NSCLC）早期复发的重要因素。

我们使用MLAD-seq方法分析RARB基因启动子中Chr3:25428373–25428436区域CG位点的5mC水平。来自肿瘤或肿瘤邻近肺组织的基因组DNA通过M.MpeI-N374K进行羧甲基化标记，然后进行A3A脱氨和Sanger测序（图5A-D）。我们利用MLAD-seq对目标序列中9个CG位点的5mC水平进行了定量，结果表明，在肺癌DNA中，RARB基因启动子区7个CG位点的5mC水平显著升高（p<0.05，图5E）。我们也采用传统亚硫酸氢盐测序法对同样位点的5mC进行了定量，结果表明，MLAD-seq定量的5mC水平与亚硫酸氢盐测序的定量结果相当（皮尔逊相关系数>0.92，图5F和5G）。

图5 利用MLAD-seq定量检测RARB基因启动子中的5mC

综上所述，我们开发了一种用于DNA中CG位点5mC的单碱基分辨率定量检测的方法——MLAD-seq。MLAD-seq方法利用胞嘧啶的选择性羧甲基化，通过M.MpeI-N374K甲基转移酶在CG位点形成5camC，根据A3A蛋白对5camC和5mC的差异脱氨实现5mC的定位分析。利用开发的MLAD-seq方法，我们观察到人类非小细胞肺癌基因组DNA中RARB基因启动子的高甲基化。因为整个过程是在温和条件下进行的。MLAD-seq不会像亚硫酸氢盐测序所报道的那样降解DNA，因此适用于较低用量DNA中5mC的研究，如单细胞DNA、细胞外DNA（如cfDNA）和福尔马林固定石蜡包埋DNA。我们设想，未来可以结合高通量测序，通过所提出的MLAD-seq方法实现对5mC的全基因组定位。

文章编号：112

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.2c03808

原文引用：

Jun Xiong^#, Ke-Ke Chen^#, Neng-Bin Xie, Tong-Tong Ji, Si-Yu Yu, Feng Tang, Conghua Xie, Yu-Qi Feng, Bi-Feng Yuan^*. Bisulfite-free and single-base resolution detection of epigenetic DNA modification of 5-methylcytosine by methyltransferase-directed labelling with APOBEC3A deamination sequencing. Anal Chem, 2022, 94(44):15489–15498. （#为共同第一作者）