今天给大家分享一篇最近在Angew. Chem. Int. Ed.上发表的研究进展，题为：Chemical Tagging of Protein Lipoylation。作者报道了一种由碘乙酰胺辅助的硫辛酸酯-环辛炔偶联的方法，实现了蛋白质硫辛酸化的化学标记，并应用于细胞成像和蛋白质组学分析。该工作的通讯作者是来自北京大学化学与分子工程学院的陈兴教授。

蛋白质的硫辛酸化是一种保守的翻译后修饰。不论是在细菌还是哺乳动物体内，都有将蛋白质的赖氨酸残基进行硫辛酸化的硫辛酰胺酶。在大肠杆菌内，有三种蛋白质被硫辛酸化，且这三种蛋白质都参与重要的细胞代谢。同样的，在人体内有五种硫辛酸化的蛋白质，而这些蛋白质硫辛酸化的失调与多种疾病有关，如高甘氨酸血症、癫痫等。

尽管蛋白质的硫辛酸化如此重要，但由于缺乏有效的标记和富集方法，对硫辛酸化的蛋白质组学分析尚不明确。虽然市面上已经有抗硫辛酸(anti-LA)的抗体，并已经对小鼠的硫辛酸化的蛋白质进行免疫沉淀和组学分析。然而由于抗体的亲和力不够强，所以这种方法不能将与硫辛酸化蛋白质相互作用的蛋白质分开。另外一种方式是通过化学偶联进行选择性标记，这种方法的干扰小，且亲和力强，有望实现硫辛酸化蛋白质的组学分析。

在本文中，作者报道了一种由碘乙酰胺辅助的硫辛酸酯-环辛炔偶联方法(iLCL)，该方法可以选择性地将荧光基团以及亲和标签与硫辛酰胺进行化学偶联，并可通过凝胶电泳和荧光成像技术进行检测。

图1. 基于iLCL对硫辛酸化的蛋白质进行化学标记的流程图

作者首先分析了1,2-二硫戊环和未成环的二硫键的反应性区别，发现1,2-二硫戊环的构象接近重叠式，能量更高，因此反应性更高。随后使用硫辛酸(LA)作为小分子模型与碘乙酰胺(IAA)反应，进一步水解得到的次磺酸由于不稳定生成了硫代亚磺酸盐，并通过高效液相质谱检测到了这种产物。而带线性二硫键的3,3’-二硫代丙酸(DTA)则不与IAA反应，证明了IAA的反应特异性。另外，作者选择环辛炔与上述水解产物进行偶联标记，小分子模型反应也验证该方法的可行性。为了避免蛋白游离的巯基与环辛炔的副反应，作者首先使用N-乙基马来酰亚胺(NEM)屏蔽巯基(如图1)，然后用IAA与1,2-二硫戊环反应，最后环辛炔与水解得到的次磺酸共价偶联。

图2. 用iLCL标记纯化的硫辛酸化的蛋白。

随后作者选用牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白，验证并优化了iLCL的标记。作者首先屏蔽BSA的巯基(tb-BSA)，然后用LA-NHS处理制备了硫辛酸化的BSA(LA-BSA)。用IAA和氮杂二苯并环辛炔-Cy5(DBCO-Cy5)对LA-BSA进行处理，然后用凝胶内荧光扫描分析。如图2结果显示，只有LA-BSA有明显强烈的荧光信号，验证了该化学标记的特异性。此外，iLCL标记依赖于IAA的浓度，增加反应时间、反应温度和DBCO-Cy5的浓度均可促进反应。

为了证明iLCL的生化应用，作者成功利用该方法检测出大肠杆菌中已知的三种硫辛酸化的蛋白，并可鉴定这三种蛋白的硫辛酰化位点。接下来，作者又对细菌、哺乳动物细胞和组织的裂解液进行iLCL标记，荧光凝胶扫描结果显示出多条硫辛酸化蛋白的条带。

最后，作者应用iLCL对细菌和哺乳动物细胞中硫辛酸化的蛋白质进行了组学分析(如图3)。使用高置信过滤器分析，分别有6个和9个蛋白质被候选为硫辛酸化的蛋白质，其中3个已知的大肠杆菌和5个已知的哺乳动物内的硫辛酸化蛋白均被鉴定出来(图3b红点)，证明了iLCL方法对蛋白质组学的广泛覆盖。

图3. 通过iLCL对硫辛酸化的蛋白质进行组学分析

综上所述，作者发展了一种化学选择性连接(iLCL)，用于蛋白质硫辛酸化的化学标记。该方法不仅能够以极高的灵敏度和特异性检测蛋白质的硫辛酸化，还能进行大规模分析和富集硫辛酸化的蛋白质，并进行蛋白质组学分析。此外新发现的候选硫辛酸化的蛋白也将成为未来研究的热点。

作者：LJH 审校：SJL

DOI: 10.1002/anie.202010981

Link: https://doi.org/10.1002/anie.202010981