今天分享一篇JACS上的文章：Photoproximity Profiling of Protein-Protein Interactions in Cells，文章的通讯作者是来自芝加哥大学的助理教授Raymond Moellering, 他们课题组的研究方向包括疾病的代谢通路和相关蛋白的翻译后修饰、化学蛋白质组学技术、化学探针开发以及合成生物学等。

      阐明活细胞内分子相互作用网络是生物学中的一个重大挑战，而在广泛的生物学背景下开发有效的鉴定相互作用网络的方法，将有助于人们理解细胞如何在空间和时间分辨率上进行生理调控，加深对细胞信号转导的理解。为了鉴定高质量的相互作用网络，人们必须开发能够检测瞬时结合相互作用的方法，同时维持生命系统中空间、化学环境稳定。因此，作者设计了一种新型光激发邻近蛋白相互作用(PhotoPPI)分析平台，它利用光在活细胞中触发邻近蛋白标记，且该方法具有高度的时空可控性，理想情况下不会对细胞环境造成明显的干扰，这将为研究蛋白-蛋白相互作用提供更高效的研究途径。

       作者设计的基于PhotoPPI化学蛋白质组学方法，包括以下部分：1)活细胞中目的蛋白的特异性探针标记；2)探针光激活和近端标记的时空控制；3)细胞裂解后标记蛋白的富集和鉴定。首先，将已知的感兴趣的目的蛋白（POI）预先用“SNAP-Tag”进行特异性地标记形成融合蛋白（SNAP-POI），然后利用具有苄基鸟嘌呤(Bng)识别元件的化学探针PP1特异性标记SNAP-POI。作者使用的是光切割探针，其中Bng靶向元件连接到光反应元件，当使用365 nm光照射时，nitroveratryl carbamate和tethereddiazirine被切割并且从SNAP-POI扩散，同时暴露出高活性卡宾，随后PP1的二嗪部分连接到检索标签（文章使用的是生物素）用于识别和富集活细胞中共价标记的蛋白质，从而鉴定到感兴趣的目的蛋白的相互作用蛋白。

        基于PhotoPPI分析技术，作者在活细胞中完善了氧化还原调节的传感器蛋白KEAP1的相互作用图谱。首先，作者构建了SNAP-KEAP1蛋白，分别转染到heavy和light标记的SILAC细胞，然后用PP1探针进行处理，经过光切割、beads富集、LC-MS/MS鉴定。结果表明，该方法一方面在基础条件下成功验证了已经被注释过的KEAP1与PGAM5和HK2等蛋白相互作用，说明这个方法是准确可靠的。另一方面，作者还发现了KEAP1的另一种新的相互作用模式：即经历代谢或氧化还原压力的细胞， KEAP1参与的并不是已知的许多基础相互作用，而是与溶酶体运输和蛋白水解蛋白(如SQSTM1、CTSD和LGMN)相关。

      总而言之，文章报道了一种PhotoPPI平台作为光激发邻近标记蛋白质组学的新方法，有利于阐明生命系统内的分子相互作用网络。

本文作者：MB

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b06528

文章引用：10.1021/jacs.9b06528