J. Am. Chem. Soc. | 利用NHS活化酯位点特异性的蛋白质标记

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推荐一篇发表在JACS上的文章:Site-specific Protein Labeling with NHS-Esters and the Analysis of Ubiquitin Ligase Mechanisms,文章的通讯作者是来自哈佛医学院布列根和妇女医院的Philip A. Cole教授,他们组主要致力于利用化学生物学的方法研究蛋白质翻译后修饰和调节。


对于蛋白质的结构,功能,机制方面的研究,往往基于赖氨酸的蛋白质荧光,亲核标签,交联以及固定试剂的标记,这些试剂常常是以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化酯作为反应基团的衍生物,目前有超过1000种以上的商业化可获得的NHS活化酯的标记试剂用于蛋白质科学以及常规试剂中,如NHS-生物素,NHS-荧光素等等。 

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但是尽管现在这些试剂非常易于获得且被广泛的实验,NHS活化酯在蛋白质上的修饰反应缺乏位点选择性导致其应用受到限制,由于NHS 活化酯选择性标记在蛋白质的氨基基团上面,大部分的蛋白质都含有很多氨基(一个含有250个氨基酸的蛋白质大约预测其中包含20个左右的赖氨酸),非选择性的标记蛋白质中赖氨酸侧链上的氨基可能会导致蛋白质构象,功能改变,使得生物物理方面的分析变得复杂,自然化学连接反应是一种蛋白质半合成中非常常用的一种策略,这种化学选择性反应主要是将一段肽的N端半胱氨酸和另一个肽的C端硫酯连接起来。蛋白质中的N端半管氨酸残基可以由插入诱变以及利用TEV或是SUMO蛋白质水解酶进行位点特异性水解获得。目前利用合成的硫酯肽与重组蛋白的N端半胱氨酸连接反应非常常用,但是与小分子硫酯的连接反应还比较少,且对很多生物学家来说化学合成小分子硫酯也是一个很大的障碍。

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本篇文章作者发展了一种简单有效的将NHS活化酯位点特异性地插入蛋白质N端半胱氨酸的一锅法标记反应:将NHS活化酯与巯基乙烷磺酸盐(MESNA)反应发生转酯化,进一步可以将产物位点特异性连接在蛋白质的N端半胱氨酸上。

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首先作者将谷胱甘肽S转移酶(GST)以及尿嘧啶DNA糖苷酶(hUNG2)作为model蛋白利用NHS活化酯衍生的荧光团以及生物素对N端蛋白标记反应进行验证。进一步作者利用这种标记技术对E3泛素连接酶WWP2 的活性包括与一个肿瘤抑制抑制因子底物PTEN与WWP2自泛素化分子数进行进一步阐释。

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WWP2含有一个催化的HECT结构域,其中含有一个活性半胱氨酸位点C838,可以从泛素-E2硫酯中获得泛素进一步生成泛素硫酯中间产物进一步将泛素修饰在自身的半胱氨酸上或是他的蛋白底物如PTEN上面,而其中连接WW2和WW3的linker是一个非常重要的自抑制WWP2泛素连接酶活性的片段,所以作者设计并利用本文开发的方法得到了F-∆C2-WWP2, F-∆C2/∆2,3-linker-WWP2 and F-HECTWWP2三个标记上荧光的蛋白。

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进一步与PTEN共孵育测其荧光各向异性从而得到对应的KD值,发现在丢失或是取代2,3-linker之后,PTEN与WWP2的结合力降低。且将C838突变为S,并用分别用biotin和荧光团标记进一步确定WWP2的自泛素化更主要是发生在分子内而不是分子间。


本篇文章开发了一种新的基于NHS活化酯的一锅法选择性标记蛋白质N段半胱氨酸策略,为以后蛋白质科学的研究提供了很好的工具。


本文作者:YF

原文链接:https://dx.doi.org/10.1021/jacs.8b05098

原文引用:J Am Chem Soc. 2018 Aug 1;140(30):9374-9378. doi: 10.1021/jacs.8b05098. Epub 2018 Jul 23.


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