今天给大家分享一篇发表在JACS上的文章，文章标题为“Bicyclic Picomolar OGA Inhibitors Enable Chemoproteomic Mapping of Its Endogenous Post-translational Modifications”。其第一通讯作者是来自加拿大Simon Fraser University的教授David J. Vocadlo。其课题组主要致力于(i) 作用于糖缀合物的糖酶，(ii) 开发化学工具来干扰这些酶的作用以及监测糖缀合物，以及 (iii) 使用这些化学工具来获得关于酶和糖如何调节细胞和有机体生理过程的信息。

细胞核或者细胞质蛋白中丝氨酸或苏氨酸残基上的N-乙酰氨基葡萄糖修饰 (O-GlcNAcylation)是广泛存在于所有多细胞真核生物中的翻译后修饰。尽管细胞内有上千种蛋白质存在O-GlcNAc，但在生物体中只有两种酶调节这种修饰， O-GlcNAc糖基转移酶 (OGT)以及 O-GlcNAc糖基水解酶(OGA)，分别用于对相应蛋白进行O-GlcNAc修饰和去O-GlcNAc修饰。由于 O-GlcNAc 在生物体生命过程中的重要性，控制O-GlcNAc修饰的两种酶受到了研究人员的广泛关注，其中，这两种酶的抑制剂在研究过程中发挥了重要作用，为 O-GlcNAc 调节蛋白提供了结构性见解。

图1 OGA从底物蛋白中切割O-GlcNAc的催化机制和OGA的各种抑制剂

OGA 是一种双结构域酶，包含一个无活性的乙酰转移酶结构域和一个糖苷水解酶(GH84)结构域。与人类 OGA (hOGA) 的GH84 结构域的活性位点结合的抑制剂能够控制细胞和组织中 O-GlcNAc 的水平，为O-GlcNAc调节的分子机制的研究提供帮助，有助于研究人员了解从分子到有机体水平的 O-GlcNAc 循环途径。在本文中，为了研究O-GlcNAc途径的生化和细胞功能，作者根据OGA的催化机制，结合各种抑制剂的有利结构特征，合成了高选择性的高效OGA抑制剂，并利用该抑制剂设计了一种化学蛋白质组学探针，对内源翻译后修饰进行了化学蛋白质组学分析。

首先，作者以带有异硫脲基团的双环亚氨基糖为母体，通过改变环外氮原子上的取代基，合成了一系列潜在的hOGA抑制剂分子（图二）。随后，作者使用Res-GlcNAc测试了这些化合物对hOGA的抑制效果。结果表明，对环外N原子不同类型的修饰会显著影响其抑制效果，将芳环定位在远离内环氮的位置会显着增强它们对 hOGA 的抑制作用，苯环上的给电子取代基叠氮甲基也增强了抑制效力，Ki值最低可达0.22 nM，同时对hOGA有很好的选择性(22)。

图2 各种抑制剂分子的合成

在得到以上结果之后，作者试图了解这些双环抑制剂抑制 OGA 的分子基础。从用16孵育的 hOGA 催化域晶体获得的衍射数据表明，催化残基 D174 和 D175 与化合物16接合，其中 D174 氢键与 2-乙酰氨基基团， D175 氢键与环外氮接合。正如在与底物和过渡态类似物的复合物中所见， 2-乙酰氨基基团通过与 W278、Y219 和 N280 的相互作用进行定向。哌啶环 C3 和 C4 位的羟基与 G67 的主链氧和 K98、D285 和 N313 的侧链形成氢键。由来自其中一个单体的 F223 的残基和另一个单体的 P678' 和 W679' 的残基形成的疏水口袋通过 π 堆叠与16的苯基相互作用。

图3 抑制剂13 – 24对 hHexA Ki(μM)和hOGA Ki(nM)的抑制常数(Ki)

图4 化合物16与hOGA结合位点分析

随后，作者使用神经元细胞模型 SK-N-SH 分析了这些化合物37对蛋白质 O-GlcNAcylation的剂量依赖性抑制作用。使用具有相似效果的化合物 Thiamet-G 作为对照，作者发现37在增加细胞 O-GlcNAc 水平方面同样有效。通过使用泛特异性抗-O-GlcNAc 和抗-OGA 抗体监测O-GlcNAc 和OGA 的水平，免疫印迹结果表明，化合物37在nM 浓度下对OGA有一定的抑制效果。

图5 化合物37对OGA的抑制作用

图6 化学蛋白质组学富集工作流程，以及从牛脑组织中沉淀 bOGA

作者根据化学蛋白质组学的一般策略，使用 DNJNAc-6S-NBn-Biotin 从牛脑组织中获得内源性OGA。在获得OGA蛋白沉淀之后，作者利用添加强效抑制剂 Thiamet-G作为对照组，通过免疫印迹分析 OGA 免疫印记表明 DTT 使得 OGA被洗脱，且释放得到的 OGA 具有大约 130 kDa 的分子量，与其已知分子量相吻合。

最后，作者利用二级质谱分析了内源性OGA的翻译后修饰类型与相应位点，发现了OGA上的九种翻译后修饰，包括O-GlcNAcylation、赖氨酸乙酰化、赖氨酸 N-甲酰化以及 O-和 N-泛素化等。这些修饰位点中的大多数以前是未知的，且几乎所有修饰位点都存在于蛋白质表面。这些靶向测序数据证实了先前使用高通量蛋白质组学分析确定的几个修饰位点，并揭示了牛脑 OGA 上的多个新的翻译后修饰位点。

图7 牛脑内源性 OGA 的翻译后修饰图谱

总之，作者开发了皮摩尔级的OGA抑制剂，并将其应用到化学蛋白质组学探针的设计中，合成了一种高亲和力化学蛋白质组学探针，可以从大脑中简单地一步纯化内源性 OGA，进而对其翻译后修饰进行靶向蛋白质组学定位，揭示了一系列新的翻译后修饰，包括O-泛素化和 N-甲酰化等。作者认为这些抑制剂和化学蛋白质组学探针可以作为研究OGA细胞底物选择性机制的基本工具。

文章作者：HYD

DOI：10.1021/jacs.1c10504