分享一篇发表在JACS上的文章，文章的题目为“Intercepting a Mycobacterial Biosynthetic Pathway with Covalent Labeling”，通讯作者为来自麻省理工学院化学系的Daria E. Kim和Laura L. Kiessling。Laura L. Kiessling研究团队研究兴趣集中在阐明和利用细胞表面识别过程的机制。这篇文章提出了一种创新的“探针生成（probe-genic）”策略，成功实现了分枝杆菌细胞膜内层的特异性标记，为研究其致病机制和开发新型诊疗工具提供了突破性手段。

分枝杆菌是威胁全球公共卫生的重要病原体。其独特的细胞膜结构——尤其是外层的霉菌膜（mycomembrane）既是感染宿主的关键武器，也是抵御抗生素的天然屏障。霉菌膜由内、外两层磷脂构成：内层通过酯键连接分枝菌酸（mycolic acid）和阿拉伯半乳聚糖（AG），外层则以海藻糖为载体的分枝菌酸为主。然而，由于糖类分子的化学同质性和功能基团匮乏性，传统标记技术难以精准靶向这一结构。过去，研究者常通过代谢标记或模拟天然底物的策略引入标记基团，但这些方法存在非特异性标记、脱靶率高、跨膜递送效率低等局限。因此，开发一种能选择性标记内层、并揭示其生物合成动态的工具，成为该领域的迫切需求。

在本文中，作者提出“探针生成”概念，通过设计一种前体分子，其活性基团仅在目标酶作用下才会暴露，从而实现精准标记。作者以分枝菌酸衍生物合成中的关键酶——转酰基酶（mycolyltransferase，如Ag85家族）为靶点，设计了叠氮取代的反式β-内酯探针（AzLac）。

AzLac中核心β-内酯结构作为“保护罩”，仅能被转酰基酶的活性位点丝氨酸（Ser124）特异性打开，释放β-羟基分支结构，从而模拟天然分枝菌酸的构象。酶促开环后，AzLac与转酰基酶形成共价中间体，随后通过转酯反应，将含叠氮基团的分枝菌酸类似物锚定至霉菌膜内层中。作者通过不对称合成获得(R,R)-构型的AzLac，其空间取向与天然底物高度匹配，确保酶促反应的高效性和特异性。

研究团队通过体外到体内的多维度实验验证了AzLac的效能。在体外酶活实验中，作者发现AzLac显著抑制Ag85A和Ag85C对荧光底物（N-QTF）的水解活性，证实其与酶活性位点的共价结合。利用流式细胞术和荧光显微镜技术，作者发现AzLac可高效标记结核分枝杆菌（Mtb）、耻垢分枝杆菌和谷氨酸棒状杆菌，但对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌无标记活性；分离细胞膜组分后，叠氮信号仅富集于内层mAGP，与外层海藻糖分枝菌酸探针（N-QTF）形成互补，验证了AzLac在细胞标记中的特异性。

荧光漂白恢复实验（FRAP）表明，AzLac标记的组分完全固定，符合mAGP共价连接的特征。而利用谷氨酸棒状杆菌转酰基酶缺失株，锁定Cmt2为AzLac的主要作用靶标，揭示了内层分枝菌酸合成的关键酶。

作者将相关技术进行实际应用，展现出极其广阔的使用场景：通过将DNA条形码通过AzLac锚定至分枝杆菌表面，实时监测感染动态和宿主-病原体互作；AzLac标记的内层分枝菌酸是结核杆菌免疫逃逸的关键组分，通过解析其生物合成通路为抗结核药物设计指明方向；而“探针生成”策略可拓展至其他酶-底物系统，例如通过掩蔽/暴露特定基团标记蛋白质、脂质或核酸，推动化学生物学工具的革新。

本文作者：CHY

责任编辑：TZS

DOI：10.1021/jacs.4c17913

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c17913