英文原题：Cell-surface Labeling via Bioorthogonal Host−Guest Chemistry
通讯作者：Ellen M. Sletten教授
供稿: 李佼峰，北京大学
大家好，今天为大家分享一篇ACS Chemical Biology文章，题为“Cell-surface Labeling via Bioorthogonal Host−Guest Chemistry”，本文的通讯作者为加利福尼亚大学的Ellen M. Sletten教授。
众所周知，生物正交化学报告策略是化学生物学的重要研究手段，研究者先引入非天然代谢物，随后通过共价化学进行正交标记，借助不同非天然官能团的引入，此策略可以有效拓展研究的生物分子范围。但是这种策略受到二级反应动力学常数的影响，通常需要高浓度的标记试剂和活泼的化学报告基团。由于高浓度的活性官能团往往会导致较高的背景，其在动物模型中的应用受到了挑战。为了克服这些困难，一些新的生物正交化学反应被发展，例如四嗪偶联反应，其动力学常数比早期的反应提高7-10个数量级，但是化学报告基团的尺寸和稳定性仍然限制了代谢插入效率。
图1.活细胞中的生物分子标记策略
A.生物正交化学报告策略；B-C.生物正交化学、生物正交化学络合的优势、挑战和举例
由此作者提出可以利用主客体化学执行生物正交化学报告策略，命名为生物正交络合，以便于更好的区分于共价的生物正交化学。这种策略的优势在于：速率快，接近水中的扩散速率；没有活性官能团，因此副反应少；可逆作用使得非特异标记被修正。这些优势在检测低浓度、复杂环境中的化学报告基团将会十分有利。其中最为人熟知的生物素-亲和素对，由于其内源存在且尺寸较大，限制了进一步的应用。而生物正交络合领域的挑战正来源于选择性主客体对的发展，需要开发小尺寸的客体，在被代谢插入的同时，有足够高的Ka值以促进有效标记。
在此，作者首先想要测定细胞表面标记所需最小Ka。目前，葫芦脲骨架（CB[7]）和高亲和力的客体（金刚胺和二茂铁胺）已经被用来分离和标记活细胞和固定细胞中的蛋白，表明其可以成功检测细胞表面的高亲和力客体。作者对一些中低亲和力的客体十分好奇，因为通常来说这些客体尺寸小，为代谢插入提供了更多可能。
图2.细胞表面标记所需生物正交络合的最小Ka
A.生物正交络合实验评价需要的最小Ka值；B.CB[7]-FITC由CB[7]-N3和1制备；C.不同Ka值的客体（2-6）；D、E流式细胞仪分析CB[7]-FITC与不同客体的生物正交络合反应的直方图和柱状图（用1 mM的NaIO4在0°C氧化Jurkat细胞10分钟，然后用2 - 6 (500 μM)和苯胺（10 mM）在0°C孵育1小时，然后用CB[7]-FITC (1 μΜ)在0°C处理细胞30分钟，并用流式细胞仪分析）
因此，为了确定生物正交络合的极限，他们将客体通过肟连接至Jurkat细胞表面，然后直接标记葫芦脲-荧光素偶联物(CB[7]-FITC)进行流式检测。作者选择葫芦脲的多种客体进行实验，其中Ka跨越106−1014 M−1，以确定最小Ka值和达到统计显著差异的最低浓度(图2C)。他们先在细胞表面展示客体2-6，然后和1 μM CB[7]-FITC共孵，发现大部分客体都能使细胞带上荧光标记 (图2D和2E)，除了最低Ka值的客体(2, Ka=106 M−1)，其在任何浓度都没有显示标记，也就是说108 M−1是非共价标记的Ka基准。当然如果有其他方法可以增加细胞表面的客体浓度或使用更低本底结合的主体，这一Ka阈值可能会降低。
图3.生物正交络合和生物正交化学的比较
A.生物正交化学（SPAAC）和生物正交络合 （Ka=109 M-1）的实验图解；B-D. Jurkat细胞先通过1 mM的NaIO4在0°C氧化10分钟，然后用4，7 (500 μM)和苯胺（10 mM）在0°C孵育1小时，然后用1和CB[7]-FITC (10 μΜ)在0°C处理细胞45分钟进行荧光标记，细胞用7，1处理后用α-荧光素 IgG-CF640R在0°C标记两次，每次15min，用流式细胞仪分析
随后，作者通过剂量和时间依赖性实验进一步探索了生物正交络合要求。然而随着CB[7]-FITC浓度提高(2-10 μM)，标记效率并没有显著提升。探究客体4-6的低浓度极限时发现，低至纳摩尔浓度下即可产生标记，浓度比用于生物正交化学标记细胞表面的报告基团低2-3个数量级。客体6和1 μM CB[7]-FITC的时间依赖实验显示标记速率很快，三十分钟后信噪比即从9增加到22。有趣的是，流式细胞术直方图显示细胞有两个明显的分群，表明细胞表面客体的可及性存在差异。
后续作者想将生物正交化学和生物正交络合进行系统比较，因此选择SPAAC反应和中等亲和力的CB [7] -FITC、(三甲基硅烷基)甲胺作为主客体。细胞表面先用肟连接上4和7，随后分别用10 μM CB[7]-FITC和1处理，其中CB[7]-FITC处理后信噪比为6，而10 μM 1处理后并没有显著差异。采用传统的信号放大步骤，用荧光素IgG-CF640R偶联物处理，结果有一定差异(见图3B、D)；增加1浓度(100 μM)可以将信噪比提高到3.5，但仍低于生物正交络合。由此，作者展示了主客体作用在生命系统中标记的高信噪比潜力。
图4.CB[7]客体的代谢插入，用生物正交络合标记
A.由唾液酸前体8和9制备11；B-D. BJAB K20细胞先在含11（0-50 μΜ）的培养基中培养，换培养基后用20 μΜ CB[7]-FITC在0°C处理30min，用流式细胞仪分析
肟连接使作者得以直接比较生物正交络合和生物正交化学，但是想要应用于生物正交化学报告策略，客体必须代谢插入。寡糖的代谢过程使得客体可以被修饰至唾液酸残基，从而展示在细胞表面。考虑到大多数已知的CB[7]客体在生理条件下都是大分子和阳离子，图2中大多数客体的插入将极具挑战。作者尝试将最小的客体(三甲基硅烷基)甲胺作为唾液酸衍生物进行代谢插入，但没有成功，可能主要因为客体是阳离子。随后，作者将注意力转向了最近报道的中亲和力中性CB[7]客体碳硼烷，使用基于流式细胞仪的凝集素检测方法，确证了工程化低唾液酸BJAB K20细胞中11的成功插入。后续用CB[7]-FITC通过生物正交络合也可进行细胞表面的标记(见图4C、D)，其中较高的CB[7]- FITC浓度(20 μM)可能是低唾液酸细胞系背景较高，也可能是由于细胞中Ka值较低。作者设想碳硼烷的独特性质将会使生物正交络合进一步拓展应用，客体优化允许插入更小的中性客体的开发，或许可以适用于野生型细胞系。
总之，作者介绍了生物正交络合作为生物正交化学的互补策略，以用于化学报告基团的标记。生物正交络合效率依赖于热力学，作者确定Ka值≥108 M−1对于细胞表面化学报告基团的检测十分必要。这是一个可以通过分子设计实现的门槛，为生物正交主客体对的发展提供了机会。浓度依赖的研究和与SPAAC的直接比较证实了相比生物正交化学，生物正交络合的低浓度试剂是达到高信噪比标记的必要条件，低浓度和低背景克服了生物正交化学的长期挑战。最后，碳硼烷唾液酸衍生物的代谢插入及葫芦脲荧光偶联物的检测使得生物正交络合成功应用于化学报告基团策略，进一步拓展了生物系统研究的化学工具箱。
ACS Chem. Biol. 2021, ASAP
Publication Date: October 20, 2021
DOI:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.1c00494
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