推荐一篇发表在ACS Central Science上的文章，文章标题是“Inserting “OFF-to-ON” BODIPY Tags into Cytokines: A Fluorogenic Interleukin IL-33 for Real-Time Imaging of Immune Cells”。通讯作者是来自再生与修复研究所炎症研究中心的Marc Vendrell教授，主要致力于开发动态可激活荧光团作为新型化学工具，以解决基本的生物学问题并将其转化为临床的研究。

细胞因子与免疫细胞相互作用在组织稳态和多种疾病期间发挥着重要的功能。例如，白细胞介素-33 （IL-33），是一种先天性和适应性免疫中的关键细胞因子，其与 ST2 细胞表面受体的相互作用导致下游 NF-κB 和 AP-1 通路的信号转导。虽然用于免疫相关蛋白成像的可激活探针很常见，但许多免疫功能是由细胞因子与其同源受体之间的结合事件介导的，而活细胞成像难以监测这些事件，因此靶向荧光团的分子设计能够实现对其实时监测。

课题组前期工作中报道了环境敏感型BODIPY氨基酸的合理设计与合成以及整合到多种肽中用于靶向成像，然而，目前尚未有报道BODIPY荧光标签在蛋白质上的衍生化。于是，作者设计了一个化学平台，将 “OFF-to-ON” BODIPY 荧光团特异性地引入完整的细胞因子蛋白中，并产生第一个 IL-33 的天然样荧光类似物，将其用于活细胞中IL-33 与ST2介导的信号转导的实时成像。

以往的研究中，Sisido 小组首先报道了将 BODIPY-FL 氨基苯丙氨酸 （aPhe） 衍生物掺入大蛋白的范例，BODIPY-FL 是一种小尺寸荧光团，但它不具有对环境敏感的特性，无法对信号转导事件进行免洗成像。为了克服这一缺点，作者设计了一系列如图1所示的基于BODIPY的适应蛋白质标记的荧光基团。基于 BODIPY-FL 或四甲基 BODIPY 支架的化合物 1-3 表现为始终开启的荧光团，并且在两种环境中表现出相似的发射强度，化合物 4-6 在疏水介质中表现出环境敏感性和增强的荧光发射，证明了它们作为荧光构建单元的实用性。

通过监测胚胎碱性磷酸酶 （SEAP） 的分泌可以判断IL-33是否激活 NF-κB 和 AP-1 通路的下游信号，从而监测IL-33的活性。为了验证BODIPY 插入后是否影响IL-33的活性，作者比较了未标记的 IL-33 和三种荧光衍生物 IL-33（1）、IL-33（3） 和 IL-33（6） 在不同浓度下的生物活性，结果发现，所有衍生物均能引起下游信号转导，其程度与未标记的 IL-33 相似（图5 a）。接下来，作者使用 ST2-Fc 作为 IL-33 抑制剂和 HpBARI_Hom2 作为 ST2 抑制剂孵育细胞，确认观察到的信号是由于 IL-33 和 ST2 受体之间的特异性识别。结果发现所有组SEAP活性几乎完全降低，证实了IL-33（1），IL-33（3）和IL-33（6）的信号是响应活性白细胞介素而产生的（图5 b）。

先前研究已报道，IL-33可诱导ST2受体内化，但关于活细胞中IL-33/ST2复合物的细胞内运输和动力学的信息非常有限。鉴于 IL-33（6） 的荧光特性，作者使用免洗荧光共聚焦显微镜对 ST2 介导的内化速率进行时程分析，同时用核复染剂 DRAQ5 对细胞进行复染，并通过延时成像进行监测。结果表明，几分钟后可以观察到ST2介导的内化，使用ST2拮抗剂HpBARI_Hom2的阻断实验证实了细胞内IL-33（6）的荧光信号完全是由于与ST2受体的相互作用引起的（图5 c d)。最后，在IL-33可刺激的代表性免疫细胞系HMC1.1细胞中也观察到相似的结果（图5 e）。这些结果表明，IL-33（1）、IL-33（3） 和 IL-33（6） 保留了未标记的 IL-33 对其天然受体的结合亲和力，并且 IL-33（6） 可用作荧光报告基因，实时对 IL-33/ST2 信号转导事件进行成像。

总而言之，本文首次将BODIPY荧光团引入细胞因子中，产生了第一个具有天然生物活性谱的白细胞介素IL-33荧光类似物，证实了该方法适用于细胞因子的微创标记。最后，使用荧光探针 IL-33（6） 对表达 ST2 受体的活细胞进行免洗实时荧光显微镜检查，并证实了 IL-33 的选择性受体介导的内化及其通过内体途径的细胞内运输。该BODIPY标记平台的多功能性和模块化将加速未来用于免疫学研究的基于荧光细胞因子的生物传感器的设计。

文章作者：ZY

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.3c01125

责任编辑：LD