分享一篇2022年发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，题目是“N-Vinyl Acrylamides: Versatile Heterobifunctional Electrophiles for Thiol–Thiol Bioconjugations”。文章的通讯作者为新西兰奥克兰大学化学科学院的Margaret A. Brimble教授。在保留其功能和结构完整性的同时，对肽和蛋白质进行位点选择性化学修饰已经成为一种多功能和强大的工具，可以获得具有无数不同应用的宝贵的多组分偶联物，例如药物输送，医学诊断，活细胞成像以及分子和细胞生物学。近年来，用于修饰典型氨基酸(如半胱氨酸和赖氨酸)的化学工具箱得到了极大的扩展。特别是半胱氨酸，由于其低丰度(1.7%)，长期以来备受关注的位点选择性蛋白修饰。此外，半胱氨酸硫酸盐固有的亲核性使其能够在生理条件下与亲电试剂快速反应形成硫醚。迈克尔受体和烷基化剂历来是半胱氨酸选择性修饰最广泛使用的试剂。马来酰亚胺化合物作为Michael受体处于前沿，尽管在高pH值下与赖氨酸氨基酸残基侧链发生交叉反应或通过反Michael反应解偶联，但仍能精确修饰含硫醇分子。年来，以马来酰亚胺为基础的蛋白质偶联的替代品也获得了发展势头，例如Hachenberger等人引入乙烯基膦硫酸盐亲电试剂作为半胱氨酸反应试剂用于肽/蛋白质修饰， Pentelute等人采用全氟芳香试剂用于π-夹介导的半胱氨酸偶联，和由Bernardes等人开发的羰基丙烯酸试剂，用于抗体上半胱氨酸残基的选择性不可逆修饰。随着该领域的成熟，人们的注意力集中在制备双功能亲电试剂上，如二乙烯基嘧啶、二溴代亚胺、二乙基膦酸盐、和二乙烯基二酯，用于硫醇偶联，这对开发治疗性肽和蛋白质偶联物特别有用。然而，含有双巯基选择性异双功能亲电试剂的连接体可用于巯基硫基生物偶联，这是偶联策略工具箱中一个值得注意的遗漏。本篇论文中作者们开发了一种基于不同反应机理的双功能巯基-巯基偶联试剂：N-乙烯基丙烯酰胺，如图1所示。N-乙烯基丙烯酰胺偶联剂包含一个可以发生硫-迈克尔（thia-Michael）加成的α, β-不饱和基团以及一个可以发生自由基“thiol-ene“点击反应的乙烯基酰胺基团。
图1. N-乙烯基丙烯酰胺双功能巯基-巯基偶联作用示意图。
在合成了N-乙烯基丙烯酰胺（1）后，作者使用Boc-Cys-OMe测试试剂的巯基反应活性和区域特性（图2）。通过结合RP-HPLC和NMR分析，作者发现在相同的反应体系中，短时间的反应（<1 min）并没有生成预期的thia-Michael加成产物，而是意外地生成了两种构型的马氏（Markovnikov）加成产物（8a和8b）。将反应时间延长至过夜后，产物就只有thia-Michael加成产物。作者认为是酰胺的N-H产生的影响，并通过DFT能量计算和使用甲基取代的N-甲基-N-乙烯基丙烯酰胺证实了该猜想。
图2. N-乙烯基丙烯酰胺与Boc-Cys-OMe反应产物。
作者通过使用Boc-Lys-OMe验证了试剂1对半胱氨酸的高选择性（图3B）。thia-Michael加成产物12被进一步测试双功能反应性。试剂12与Boc-Cys-OMe孵育了48h，没有观察到新的加成产物，证明其乙烯基在该条件下不会被进一反应（图3C）。而在365nm光照条件下，试剂12会经历光引发的“thiol-ene“自由基反应，苄硫醇作为巯基供体，安息香二乙醚（DMPA）作为自由基引发剂，生成硫醚产物13，产率在30min后达到76%（图3D）。
图3. N-乙烯基丙烯酰胺的巯基选择性验证方法和第二步巯基加成反应方法。
作者对N-甲基-N-乙烯基丙烯酰胺（试剂14）使用同样的方法测试了两个官能团的巯基反应性，同样很高，并且由于不会产生任何马氏加成产物而在接下来的研究中被使用。N-甲基-N-乙烯基丙烯酰胺类产物13的稳定性通过将其与过量(20mM)的还原型谷胱甘肽在pH7.4条件下孵育3天进行测试，RP-HPLC结果显示偶联物赋予后仍然很稳定，并且在长时间室温贮存条件下也保持稳定。充分说明N-乙烯基丙烯酰胺类偶联linker在生理条件下高度稳定，优于易脱偶联的马来酰亚胺类linker。方法建立后，作者将N-甲基-N-乙烯基丙烯酰胺用于肽段的荧光试剂的偶联（图4A和B）。将荧光基团（dansyl fluorophore）通过thia-Michael与N-甲基-N-乙烯基丙烯酰胺连接后（产物21），进一步与肽段Ac-CLYRAG-NH2进行基于自由基的加成，有机相和水相反应转化率都很高。并且与还原型GSH孵育的结果也显示产物的稳定性（图4C）。使用含K的肽段进一步证明了试剂对半胱氨酸的高选择性。
图4. N-甲基-N-乙烯基丙烯酰胺偶联荧光试剂和肽段。
最后，作者们将偶联了荧光基团的N-甲基-N-乙烯基丙烯酰胺与蛋白质进行光反应巯基偶联测试。结果显示BSA和曲妥珠单抗（Trastuzumab）（图5）的巯基都被成功地偶联了荧光基团。
图5. BSA和曲妥珠单抗通过N-甲基-N-乙烯基丙烯酰胺偶联荧光基团。
综上所述，在这篇工作中，作者们开发了一种新型的双功能巯基反应试剂N-乙烯基丙烯酰胺，该类试剂既可发生thia-Michael加成也能发生自由基thiol-ene点击反应。其中N-H对试剂的反应产物类型有关键的影响。偶联了荧光基团的N-甲基-N-乙烯基丙烯酰胺可进一步与肽段和蛋白的半胱氨酸巯基发生光催化的自由基反应，形成高度稳定的偶联产物。提供了一种新型的稳定双功能偶联试剂。
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