分享一篇发表在JACS上的文章，题目为Phosphorylation Sites of the Gastric Inhibitory Polypeptide Receptor (GIPR) Revealed by Trapped-Ion-Mobility Spectrometry Coupled to Time-of-Flight Mass Spectrometry (TIMS-TOF MS)。本文共两位通讯作者，分别为威斯康星大学麦迪逊分校的Samuel H. Gellman教授和Ying Ge教授。Gellman课题组的主要研究方向为Foldamer及其应用，Ying Ge课题组主要基于系统生物学技术研究心血管疾病。G蛋白偶联受体（GPCRs），作为真核细胞表面最大的受体家族，参与着许多重要生理过程的调控。当与配体分子结合时，GPCR将主要通过异源三聚体G蛋白，激活下游信号转导。此外，GPCR还将招募G蛋白偶联受体激酶（GRKs），将自身胞内可及的Ser与Thr残基磷酸化。上述磷酸化修饰将促进GPCR招募β-arrestin家族蛋白，进而介导受体内吞以及信号转导的终止。已有研究表明，同一GPCR的磷酸化位点，随结合的激动剂（agonist）与GRK亚型的变化而变化。差异化的磷酸化图景，对GPCR的信号转导有不同的影响。针对GPCR磷酸化位点，研究人员发展了多种研究方法，包括定点突变、32P同位素标记、磷酸化修饰抗体富集等。质谱技术最近成为了研究磷酸化修饰位点以及丰度的有效工具，然而，将其用于GPCRs为代表的膜蛋白往往面临着蛋白丰度、大小、疏水性等挑战。目前，仅有少量研究基于MS研究A类与C类GPCR的磷酸化位点。在本文中，研究人员对胃抑制多肽受体（GIPR）的磷酸化位点进行了系统分析。GIPR是B类GPCR，广泛分布于胰腺、肠道、脂肪组织、心脏、垂体和大脑等组织。其主要功能是将肠道摄入的营养物质传递给胰岛，并调节胰高血糖素和胰岛素的分泌水平，以维持餐后体内平衡。GIPR 已被视为治疗 2 型糖尿病（T2D）、心血管疾病和骨质疏松症等疾病的靶点。最近获批的T2D药物替扎帕肽（TZP）是GIPR和GLP-1R的双重激动剂。基于生物信息学软件PhosphoSitePlus，作者预测GIPR上存在2个磷酸化位点，即跨膜螺旋6中的S381和S382残基。为解决此前基于MS分析所面临的困难，研究人员使用捕集离子淌度耦合飞行时间质谱法（TIMS-TOF MS）和平行累积序列碎片模式（PASEF）来进行鉴定。PASEF模式下的TIMS-TOF MS采集速度快，灵敏度高，是发现GPCR翻译后修饰（PTMs）的理想方法。作者使用表达GIPR-Flag tag的稳转293T细胞系，通过anti-Flag抗体富集的策略解决GIPR丰度较低的问题。在激动剂刺激下，通过检测稳转系中cAMP水平的变化以及GIPR与β-arrestin-2的相互作用，作者首先证明Flag tag的引入对于GIPR功能没有明显影响。
作者使用市售设备进行TIMS-TOF MS测量，并使用标准蛋白质组学方法生成胰蛋白酶肽，从而实现了71 %的序列覆盖度，并识别了GIPR内部以前未识别的八个新的磷酸化位点，但S381和S382均未检测到磷酸化。在激动剂诱导下，作者在其中几个位点上检测到了磷酸化水平上升，而且内源激动剂 GIP（1-42）和药物TZP诱导的磷酸化模式有所不同。
综上所述，本文基于市售的PASEF-TIMS-TOF技术，对GIPR的磷酸化位点和丰度进行了系统的分析。原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.3c09078文章引用：DOI：10.1021/jacs.3c09078
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