- A+
分享一篇发表在 Nature Communications的文章，题目为“Next generation genetically encoded fluorescent sensors for serotonin”。在该项研究中，研究人员基于天然的血清素（5-羟色胺，5-HT）受体和循环排列的GFP开发了一系列基因编码的荧光传感器（sDarken），对5-HT具有不同亲和力。它们在未结合5-HT时发出荧光，结合后荧光减弱，实现了在体内外对5-HT动力学的高时空分辨率分析。同时该传感器显示了良好的膜表达能力、较高的特异性和较高的信噪比，能检测5-羟色胺的内源性释放，可适用于病毒的检测。
5-羟色胺(5-HT)作为一种激素和神经递质，被证实不仅参与多种不同的生理和中枢神经系统功能，而且还参与焦虑和抑郁等精神疾病的发展和表现。但由于缺乏高时空分辨的活体检测工具，5-HT的更多作用机制仍亟待被阐明。已开发的基因编辑传感器通常结合特定的G蛋白偶联受体(GPCR)或周质结合蛋白从而对不同神经递质的释放成像，如谷氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱等。 该课题组最初的设计是基于最近被报道的基因编辑多巴胺传感器dLight1。研究人员通过对DRD1、5-HT2A和5-HT1A的跨膜结构域进行序列比对，以确定cpGFP的最佳插入位置（下图a）。在所有变体中，天然 5-HT1A 受体的第三个细胞内环被循环排列形式的 GFP (cpGFP) 取代，该形式也用于 GCaMP6m15，这意味着还包括在 GCaMP6m 工程中引入的突变（AS 65， 75、87、92、115、118、250）。被LSSLE (linker1)和LPDQL (linker2)夹带的cpGFP被插入到原生5-HT1A受体的F224和R337之间（下图b）。 从这个最初的变体开始，研究人员对接头残基进行了突变，以改变5-羟色胺传感器的性质。总体而言，通过测量和分析了一个包含224个突变体的人胚胎肾(HEK)细胞文库，发现除了两个突变体(M24，M27)外，大多数突变体在5-羟色胺结合时减弱了它们的荧光(下图b)。因此，研究人员决定继续优化暗化传感器(即减少5-羟色胺结合时的荧光)。 研究发现，突变体M34是最有希望的候选者，具有良好的膜转运性能以及在应用800nM 5-羟色胺（下图b、c）后荧光强度显著下降(ΔF/F0=−0.71±0.01，平均值±扫描电子显微镜，n=15)。根据该5-羟色胺传感器M34的特殊功能，即与5-羟色胺结合后其荧光减弱，研究人员将其命名为sDarken(基于5-HT1A受体的5-羟色胺暗化传感器)。
由于体内应用需要稳健的响应和光稳定性，首先进行了体外的检测实验。该课题组人员研究了传感器对5-HT重复刺激的响应(下图d-f)，以及重复的光诱导释放5-羟色胺导致荧光减少(下图e)。此外，在表达sDarken的HEK细胞中进行outside-out膜片钳检测，在重复应用超高速5-羟色胺时显示出稳定的反应幅度(下图f)。
汇总分析，sDarken 在体外显示出对亚微摩尔 5-HT 浓度的强烈和大信号变化，并且对其他神经递质和类似物质没有可检测到的反应。 接下来，为了扩大检测的动态范围和得到不同5-HT亲和力传感器，以适应对体内不同生化反应的广泛适用性，课题组人员研究了sDarken结合袋内的突变是否可用于修改其对5-HT的亲和力，对5 -羟色胺结合袋内保守的天门冬氨酸和丝氨酸残基进行了位点定向取代，以获得低亲和力版本的sDarken，D82N、D116N、S198A在所有可能的组合中被引入并进行了研究。研究发现，所有突变对5-羟色胺的亲和力都较低，D116N似乎特别有希望。正如已经在最初的sDarken传感器设计中看到的那样，D116N的表达仅限于膜上(下图a)，而滴定曲线显示与5-羟色胺的亲和力(Kd45±4.6m)比sDarken(Kd127±20.7 nM)低1000倍(下图c)，D116N变异体的检测范围在100微米到1毫米之间，因此将该变异体命名为低亲和力sDarken(L-sDarken)。 在得到低亲和力版本传感器后，研发人员引入超折叠cpGFP以替换原本的cpGFP，将亲和力提高了两倍，达到57 nM(57.3±13.9 nM)，而信号振幅保持不变(下图c)，这种高亲和力变体传感器被命名为H-sDarken。
随后进行了光稳定性和膜表达情况考察，这是由于sDarken是一种基因编码的传感器，它在与5-HT结合时降低其荧光，因此记录过程中的光稳定性是长期成像的先决条件。与膜靶向表达的eGFP (CAAX-motif)相比，所有三种传感器变体都表现出相似甚至更高的光稳定性(下图e)，并且三种变体在膜上的表达同样良好，没有显示出任何值得注意的细胞内聚集(下图f)。此外，研究人员设想长期接触5-HT是否会导致传感器永久内化，结果证明并非如此。
之后又进行了动力学，体外海马体切片培养2-P成像、小鼠脑切片5-HT内源性释放成像的考察，都取得了满意的响应和成效，在这里不加以赘述。
总之,以上体外实验证明sDarken有足够的灵敏度检测内源性5 -羟色胺的释放。最后研究人员为了确定sDarken是否可以检测清醒动物体内5-HT动态，在麻醉和清醒小鼠的PFC中使用了传感器进行了活体的双光子成像。实验人员建立了一个奖励范式(下图a-e)。老鼠被训练在一个线性跑步机上(360厘米)跑步，当它们在行走表面上的特定纹理标记的三个指定奖励区域舔食后，就会获得燕麦牛奶奖励(下图b)。小鼠学习了这种模式，表现为奖励区域内舔舐次数的增加(下图d)。sdarkken在PFC不同皮层层表达(下图e-g)。 有趣的是，在第1层中，他们注意到局部5-HT动态独立于运动或奖励(下图h)。局部事件持续几秒到几分钟，包括较小的5-HT释放瞬变。这些数据表明，sDarken足够敏感，可以检测不同时间尺度上自然发生的5-HT动态。研究人员期望在奖励传递过程中观察到全局(全视野)5-HT瞬变，但这种效应仅在三分之一的动物中可见。在该实验中，单个试验中动物的荧光下降(5-羟色胺增加)，对11个奖励事件的量化显示荧光较基线显著下降(下图I, j)。在数据分析中，他们注意到所有动物的整体5-羟色胺动态与运动有很强的相关性(n = 3;下图k，l)时，运动速度的降低与荧光的减少(前脑5-HT的增加)相关，反之，当动物增加运动速度时，荧光明显上升(5-HT的减少)(下图m, n)。比较奔跑和休息期间的整体sDarken荧光，发现动物停止时荧光明显下降(下图l-o)。与跑步相关的5-HT动态在第二个范围内，τOFF = 1。2 4 s (F i g。6 o)。为了更详细地探索5-HT的动态，研究人员还分析了皮层2/3层的5-HT动态(下图p)。在一些选定的roi中，5 -羟色胺的局部变化(释放增加)导致了奖励(舔)(下图p-r)，而在其他roi中，荧光没有明显的预期变化。实验结果表明，sDarken可以用2p显微镜检测清醒动物在不同时间尺度上自然发生的5-HT动态。 综上所述，该文献设计的传感器——sDarken家族提供三种变体，结合细胞和分子特异性，具有高特异性、宽动态范围、高亲和力(nM-mM)和改进的时间分辨率。由于其高特异性和光稳定性，它们非常适合研究行为动物的血清素动态。同时该课题组的研究人员表示，sDarken家族将扩大基因编码血清素传感器的可用工具箱，有助于研究5-羟色胺在不同行为和对应大脑状态中的瞬态血清素情况。该文献设计的传感器变体将极大地促进对5-HT神经传递的综合理解，并期待未来传感器性能的进一步改进和具有不同荧光团的传感器的开发。 本文作者：ZYY 责任编辑：F C DOI：10.1038/S41467-022-35200-W 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-35200-w
目前评论：