分享一篇近期发表在Acc. Chem. Res.杂志发表题为Fluorescent Probes for Biological Species and Microenvironments: from Rational Design to Bioimaging Applications的研究论文，文章的通讯作者为南京大学的郭子建院士。生物体内的生物系统包括生物化学物质（Zn2+、Fe2+/Fe3+、Cu+/Cu2+、活性硫、硫醇等）和细胞微环境（pH、氧含量、粘度）等，它们在各种生理过程中起着至关重要的作用。揭示这些重要生物化学物质和微环境的不同生理和病理功能具有重要意义，对此进行实时检测和跟踪已成为一个重要的研究课题。荧光成像涉及在分子水平上对生物相关分析物的检测、测量和观察；近年来，荧光传感技术因其简单、快速、实时的体外和体内监测能力而蓬勃发展荧光成像的发展刺激了对荧光探针的探索，荧光探针作为监测分子相互作用的有力工具广泛应用于生物化学和医学科学。荧光探针主要由一个荧光基团、一个连接基团和一个识别基团组成。被分析物与识别基团的特定螯合或反应将改变荧光强度或发射波长，从而报告被分析物的变化分子内电荷转移（ICT）、光致电子转移（PeT）、荧光共振能量转移（FRET）等传统传感机制被广泛用于荧光探针的合理设计（图1）。
图1. （a）基于ICT机理的比例荧光探针示意图。（b）PeT荧光探针及其“开启”感应机制。（c）基于FRET的荧光探针的设计原则。
本文综述了本实验室开发的荧光探针在重要生物分析物和微环境中的设计策略和生物学应用，并将其分为金属离子、生物活性分子和生物微环境三类。
生物金属离子——Fe3+荧光探针
作为人体内含量最多的过渡金属，铁参与许多细胞过程，如新陈代谢、电子传递和DNA合成铁在生物体中几乎完全以Fe2+或Fe3+的形式存在。铁水平异常与铁死亡、贫血、血色素沉着症和阿尔茨海默病有关。根据非荧光螺内酰胺和荧光开环罗丹明之间的平衡，制备了多种Fe3+开启荧光探针，但这些探针的生物学应用大多局限于检测细胞内和细胞外的Fe3+，并且这些螯合剂对Fe3+的选择性也受到了挑战。最近，为了提高对Fe3+的亲和力，我们开发了一系列基于N2-羟乙基二乙烯三胺（HEDTA）螯合剂的Fe3+荧光探针，该探针作为羟乙基垂体形成硬碱，增强了对Fe3+的亲和力（图2a）。通过用螯合剂HEDTA修饰螺内酰胺罗丹明，构建了对Fe3+具有可逆响应的线粒体靶向探针（Mito-DRFe）（图2b）。计算出检测限（LOD）为107 nM，响应时间为 ~ 200 s。该探针发射波长较长，在DMSO诱导K562细胞分化过程中，首次观察到线粒体中不稳定Fe3+的减少（图2e）。为了实现对Fe3+的比率测量，基于FRET机制设计了四个Fe3+比率荧光探针R1-R4（图2c）。在FRET系统中，1,8-萘酰亚胺作为供体，罗丹明B作为受体。由于供体和受体之间的连接方式不同，R3和R4的供体和受体之间的能量传递能力比R1和R2更强。荧光增强可在120 s和500 s内完成，R3和R4的LOD分别为69.1 nM和70.1 nM。因此，本研究为合理构建Fe3+比率荧光探针提供了一种可行的设计策略。按照这一策略，通过连接螺内酰胺-罗丹明B并用Fe3+螯合剂HEDTA进行修饰，构建了可逆比率荧光探针（图2d）。计算得到LOD为0.13 μM，DRhFe与Fe3+的结合常数（Ka）为3.91 × 103 M−1。当探针螯合Fe3+时，生成罗丹明B，并开启分子内FRET，实现Fe3+比率传感。这种比率响应已成功应用于监测铁死亡期间细胞中不稳定的Fe3+波动（图2f）。
图2. （a）Fe3+螯合剂的化学结构。（b）Mito-Fe的化学结构。（c）Fe3+探针R1-R4的设计策略。（d）DRhFe的可逆传感机理。（e）K562细胞在含/不含2% DMSO的RPMI 1640培养基中培养的流式细胞术检测和细胞的Western blot分析。（f）采用双激发/双发射模式，DRhFe染色的erasastin预孵育HeLa细胞的比例成像。
生物硫——生物硫醇荧光探针
生物硫醇（Cys, Hcy和GSH）的内源性浓度揭示了相应酶和蛋白质的功能状态，其异常水平与疾病有关。因此，监测生物样品中的生物硫醇对于了解硫醇酶和蛋白质在生理和病理过程中的功能及其在临床诊断中的潜在应用非常重要。我们的团队开发了一种基于IR 820商业染料的特异性Cys/Hcy激活的近红外荧光和比率PA双模探针（NIR-S）（图3a）。基于Cys/Hcy的亲核取代和Smiles重排反应，PeT过程被阻断，对Cys/Hcy产生特异性的近红外荧光和比例化的PA响应。对Cys/Hcy的反应在15 ~ 25 min内达到平衡，Cys的低LOD为0.66 μM, Hcy的低LOD为1.12 μM，证明了对Cys或Hcy的体内追踪能力。为了实现动态可逆的生物硫醇传感，我们设计了一种基于ICT机制的乙烯基功能化BODIPY比例荧光探针（BDP-COOEt），该探针可以与谷胱甘肽发生可逆的Michael加成反应，破坏ICT系统，导致荧光比例变化（图3b）。探针/GSH的Kd估计为7.6 mM, BDP-COOEt对GSH的荧光响应在5 min内达到平衡。NIR-S不仅可以通过近红外荧光和PA双模成像检测溶液中的Cys/Hcy，还可以用于活细胞和小鼠的Cys/Hcy双模监测（图3c）。BDP-COOEt实时比例成像显示顺铂处理细胞中GSH水平升高（图3d）。
图3. （a）NIR-S对Cys/Hcy的比率光学/PA传感机理。（b）氧化还原循环下GSH的可逆比率传感策略。（c）注射NIR-S检测Cys/Hcy的小鼠体内荧光/比例PA双模成像。（d）实时监测铂类药物诱导A549/A549-DDP细胞GSH水平。
微环境——pH荧光探针
不同细胞器的pH值与许多生理过程有关，包括细胞增殖、细胞凋亡和吞噬作用。因此，我们将苯并咪唑（质子受体）与BODIPY结合，构建了三种pH探针，BBI-1/-2/-3，它们在酸性介质中表现出固有的BODIPY发射，在中性介质中表现出AIE发射（图4a）。其中，线粒体是能量生产中心。线粒体pH值（pHm）的维持在细胞代谢中很重要比率pH探针Mito-pH与pH敏感的FITC荧光团作为荧光供体和pH不敏感的半菁氨酸基团作为受体集成（图4b）。在酸性条件下，FITC基团中的酚羟基不能去质子化，荧光强度很弱，而在碱性条件下，酚羟基去质子化形成酚酸盐，显示出很强的ICT效应，并发出强烈的绿色荧光（~ 515 nm）。
图4. （a）感应pH的BBI探针的合理设计。（b）基于FRET的Mito-pH的比率感应pH机制。（c）用PBS和含MUS 5的PBS孵育LysoTracker Deep Red和含BBI-1的A549细胞的共聚焦成像。（d）CCCP或PMA刺激MCF-7细胞加载Mito-pH后的pHm比率变化。
双激发/双发射模式的比率pH成像显示，BBI-1染色成功监测了二氧化硅暴露诱导的A549细胞酸化，并首次直接观察到二氧化硅诱导的溶酶体破坏与细胞酸化的同步（图4c）。除此之外，由于Mito-pH具有靶向线粒体的能力，比率荧光成像和流式细胞术被用于定量跟踪氧化应激下的pHm波动（图4d）。总的来说，本文主要关注金属阳离子、生物分子和细胞内微环境的检测方法，综述了我们最近在合理设计的新型荧光探针及其在生物成像中的应用方面所做的努力。我们设计了一系列由可见光和近红外光激发的开/关/比率荧光/光声探针，用于视觉和动态地追踪细胞内甚至体内的生物化学物质和微环境。然而，用于扩展生物医学成像的实用探针仍然有限，需要进一步努力解决这一领域的挑战和局限性。考虑到生命系统的动态性，对生物体内金属离子和氧化还原态变化的实时定量监测是必要的。在金属离子中，Fe2+在铁死亡、铁自噬等过程中起关键作用。然而，由于Fe2+固有的顺磁性，对活细胞中不稳定的Fe2+进行高选择性的实时监测是一项挑战。目前，用于监测生命系统中Fe2+的探针大多表现为基于反应性的不可逆响应。因此，寻找特异性的Fe2+螯合剂和开发基于螯合策略的Fe2+荧光探针或磷光寿命探针的可逆定量检测将是未来努力的方向。对于生物硫醇、活性氧等生物活性分子的检测，构建可逆和比率检测策略对相关生理过程的研究具有重要意义。对于物质调控系统发达的生物体，无论是在体内水平还是在亚细胞水平，物种含量的异常变化都会导致病理改变。因此，我们未来将致力于开发多细胞器靶向荧光探针，研究亚细胞细胞器相互作用的机制和相关疾病的产生过程，从而调控细胞器相互作用网络，实现对疾病的治疗。在体内，利用长波光和声波穿透深层组织的原理，构建各种NIR II和PA成像双模探针，这些探针具有荧光成像的高灵敏度和光声成像的深层成像能力，可实现更深入、更灵敏的体内诊断，有望为早期病变发生转移的实时无创检测研究提供新的思路。
目前评论：