小分子荧光团是生物学研究的基本工具。罗丹明由于具有较高的荧光量子产率、较好的光稳定性、结构的可修饰性以及非荧光内酯（L）和荧光两性离子（Z；平衡常数：K_L-Z）之间的可逆转化等特性，已经被广泛应用于生物成像，如生物分子标记、细胞染色、环境检测等。其中，通过调整K_L-Z降低亲脂性非荧光内酯的形成可以改善细胞渗透性，产生“荧光”配体，与生物靶标结合后显示出显著的荧光信号。

近日，美国霍华德·休斯医学研究所珍妮亚研究院的Luke D. Lavis博士基于罗丹明荧光团设计合成了一种新型荧光团Janelia Fluor（JF₅₂₆），其形成自我标记的配体，用于内源结构的染色以及超分辨免疫荧光的自发闪烁标记。相关成果以“Rational Design of Fluorogenic and Spontaneously Blinking Labels for Super-Resolution Imaging”为题发表在ACS Central Science上（DOI: 10.1021/acscentsci.9b00676）。

（来源：ACS Central Science）

四甲基-Si-罗丹明（SiR，1；Figure 1a）是一种常见的荧光染料，表现出远红外波长，最大吸收波长为643 nm，发射波长为662 nm，荧光量子产率为0.41（Table 1），且具有优异的光稳定性。基于SiR的配体具有较低的K_L-Z值（0.0034），说明其在水溶液中是非荧光内酯的形式，具有高度可渗透性。然而，这类配体与分子靶标结合后会使平衡向两性离子转变，产生荧光（Figure 1b）。另外，作者发现用四元氮杂丁烷环替代荧光团中的N-二甲氨基可以改善物质的性质，因此作者在结构中引入3-氟代氮杂环丁烷得到JF₆₃₅（3，λ_abs/λ_em=635 nm/652 nm，ε_w=1000 M^-1CM^-1，Φ=0.54），其表现出较低的K_L-Z值（＜0.0001）和强荧光。作者还用类似方法得到了荧光染料4-7（Figure 1c，Table 1）。接着，作者又以含氧罗丹明为基本骨架得到荧光团JF₅₅₂（9）和JF₅₂₆（10）。除此之外，作者还通过将3,3-二氟氮杂环丁烷取代JF₆₀₈（4，λ_abs/λ_em=608 nm/631 nm，Φ=0.67）中的氮杂环丁烷环，得到具有明亮荧光的化合物JF₅₈₅（5，λ_abs/λ_em=585 nm/609 nm，Φ=0.78）。

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随后，作者研究了Si-罗丹明 110（8）的各项性质。作者以化合物11与氨基甲酸叔丁酯为原料，利用Pd催化的交叉偶联反应，随后用TFA脱保护得到化合物8（SiR₁₁₀，λ_abs/λ_em=587 nm/609 nm，Φ=0.53；Figure 2a）。相较于SiR，SiR₁₁₀蓝移~50 nm，但荧光量子产率增加。作者从6开始合成了SiR₁₁₀-Halo Tag配体（8_HTL，Figure 2b）并测试其光谱性质，发现其与Halo Tag蛋白结合后荧光吸收增加7倍（Figure 2c），并与K_L-Z趋势成线性关系（Figure 1e）。该染料可用于标记细胞成像（Figure 2d），且具有更好的光稳定性（Figure 2e）。以上结果进一步证明了低的K_L-Z值与罗丹明的强荧光息息相关。

（来源：ACS Central Science）

随后，作者致力于开发合成JF₅₅₂衍生物的一般策略，希望适用于不同氮杂环丁烷基官能团的取代。作者以3-溴-4-氟苯酚（17）为原料进行一系列缩合、偶联、脱保护反应得到JF₅₅₂、JF₅₅₂-HaloTag配体9_HTL（Scheme 1b）和JF₅₄₉和JF₅₅₂的甲氧苄啶（TMP）缀合物6_TMP和9_TMP（Scheme 1c）。接着，作者在酵母细胞核中对这些物质的荧光标记效果进行一定的评估。其中，6_HTL显示出较差的标记效果（Figure 3a），而9_HTL在同样条件下却表现出强荧光信号（Figure 3b）。

（来源：ACS Central Science）

接着，作者将化合物7和9的结构修饰方法结合，得到新的荧光团六氟化罗丹明10（Figure 4a）。作者用类似JF₅₅₂配体的途径合成6-羧基衍生物（Scheme 1b）；同样的，作者经过一系列交叉偶联、脱保护反应得到JF₅₂₆-HaloTag配体（10_HTL）和JF₅₂₆-SNAP-tag配体（10_STL，Figure 4b），并在活细胞中与JF₅₂₅-HaloTag（7_HTL）比较成像效果。结果表明，无论是使用HaloTag（Figure 4d，e），还是SNAP-tag配体（Figure 4f，g），JF₅₂₆均表现出比JF₅₂₅更高强度的荧光信号。

（来源：ACS Central Science）

作者进一步合成了多种JF₅₂₆配体，探究染料在多色显微成像中的应用,其中JF₅₂₆-Hoechst（10_HST）用于DNA的染色，JF₅₂₆-紫杉醇（10_TXL）用于微管的染色以及JF₅₂₆-胃蛋白酶抑制剂A（10_PEP）用于溶酶体的染色（Figure 4b and 5a）。随后作者用这些物质实现了单色、双色和三色免洗成像实验（Figure 5b-d）。同时，作者用10_PEP和JF₆₄₆-Hoechst（2_HST，Figure 6a）实现了在活细胞中的双色3D-SIM成像；用10_TXL实现了微管的多色超分辨STED成像（Figure 6b）。特别的，作者用JF₅₂₆-Taxol（10_TXL，微管），JF₆₄₆-SNAP-tag配体（2_STL，内质网）和JF₅₈₅-HaloTag配体（5_HTL，线粒体）用于活细胞的三色STED成像（Figure 6c）。用10_PEP和2_HST实现了双色格栏光片显微成像（Figure 6d）。

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最后，作者利用罗丹明染料的内酯-两性离子平衡特性进一步用于单分子定位显微成像（SMLM）。羟甲基-SiR（HM-SiR，32）主要以非荧光的螺环醚形式存在,但在生理pH下条件下，其能质子化产生瞬态荧光（Figure 7a）。为了评估HM-JF₅₂₆在SMLM实验中的性能，作者使用37标记山羊抗小鼠二抗，然后在固定细胞中免疫染色抗β-微管蛋白一抗。SMLM图像显示出微管的精细结构（Figure 7e）。作者利用抗TOMM20一抗标记线粒体，与衍射限制图像相比，罗丹明染料提供了具有更高分辨率的线粒体SMLM图像（Figure 7f-h）。

（来源：ACS Central Science）

总而言之，作者运用各种修饰方式改变罗丹明的K_L-Z值，并证明了K_L-Z在合理设计自发闪烁的罗丹明荧光团中的重要性。同时，作者探究了一种普适性方法用于荧光团结构的改造，这有利于设计合成更多小分子用于活细胞和生物体内的功能成像。