为大家分享一篇发表在JACS上的文章“Chemoproteomic Profiling by Cysteine Fluoroalkylation Reveals Myrocin G as an Inhibitor of the Nonhomologous End Joining DNA Repair Pathway”，文章通讯作者是来自Scripps研究所的Alexander Adibekian，他的研究兴趣是合成化学、生物化学与蛋白质组学的交叉方向。在本文中他们开发并深入评估了一种新的半胱氨酸选择性化学蛋白质组学探针——四氟烷基苯并氧杂环戊烷 (Tetrafluoroalkyl Benziodoxole, TFBX)。
半胱氨酸的亲核性和还原性使其在蛋白质的结构和功能中起着至关重要的作用，复杂蛋白质组中的半胱氨酸残基热点可以用反应性亲电探针实现精确定位。过去十几年已经陆续报道了多种用于半胱氨酸分析的亲电探针，但只有极少数表现出足够的反应性、化学选择性和生物正交性。碘乙酰胺炔基（IAA alkyne）探针仍是蛋白质组学领域作为半胱氨酸反应探针中的黄金标准，但它只与占比较小的高反应性半胱氨酸残基反应，且水溶液稳定性适中、靶标占有率低。开发新的半胱氨酸反应化学探针需要超越现有探针，获得更广泛的蛋白质组覆盖范围、更好的活细胞实验性能以及更高的靶标占有率。
在本文中，作者报道了一种新的四氟烷基苯并氧杂环戊烷 (TFBX)化合物探针（命名为“7”），它的设计基于先前报道的高价碘探针 JW-RF-010被进行了改造。在探针7的设计过程中作者考虑到，天然蛋白质组中不存在氟元素，而将氟原子掺入探针可提高质谱实验中蛋白质靶标和氨基酸位点定位的可信度。这种氟特征标签原则上可以通过亲电子氟烷基化作用引入到半胱氨酸亲核试剂上。因此作者先设计了氟代烷基探针3和4，其中4的五氟乙基取代基增强的亲电性实现了更广范围的半胱氨酸标记。作者继续研究制备化合物4的叠氮化物官能化衍生物，以便于用于标记可视化或探针修饰肽和蛋白质的富集，得到了最终探针7的结构。通过TNB 2-试剂测试探针的巯基反应性，相同浓度下探针7有着比先前之前报道的乙炔基苯并氧酮探针2和IAA alkyne探针1高 10 倍的反应性。
随后，作者评估了7作为化学蛋白质组学探针的性能。各类表征结果显示，探针7与参考探针1和2 相比，显示出更快的标记动力学、更深的蛋白质组覆盖度、良好的化学选择性和更高的半胱氨酸残基占有率。且7的高疏水性实现了有效穿膜，有利于其在活细胞内的高效标记。完成性能表征后，为了证明7作为化学蛋白质组学探针在靶标鉴定中的实用性，作者将7用于天然产物 Myrocin G潜在细胞靶标的研究。这是一种具有迄今为止作用机制未知的抗增殖类真菌天然产物。HeLa 细胞在裂解前用Myrocin G或 DMSO 处理 4 小时，然后用 100 μM 探针1或7处理 30 分钟，裂解物通过 CuAAC click反应富集、LC-MS/MS 进行分析。结果显示使用1作为富集探针，无法识别任何显著竞争的蛋白质靶标，而使用7时发现了 6 个竞争比率 <0.2的半胱氨酸位点。其中蛋白XRCC5（核内x线修复交叉互补蛋白5，nuclear protein X-ray repair cross-complementing protein 5）因其在修复由 γ 辐射和化学治疗剂引起的 DNA 双链断裂中的突出作用而受到作者关注。进一步研究表明myrocins (-)- 10和其类似物 (-)- 11与XRCC5 半胱氨酸 249 的共价结合降低了该蛋白的DNA 结合能力，并减缓了癌细胞在基因毒性损伤（如药物处理和紫外线照射）下的 DNA 修复。这一结果为开发更小、更简单、更有效的共价 XRCC5 抑制剂以作为具有临床潜力的抗癌剂提供了一个新的设计起点。
总得来说，本文开发了一种新的半胱氨酸标记探针，相比于先前的探针具有更广泛深入的标记性能，并利用揭示了天然产物Myrocin G 作为DNA 修复途径的抑制剂的性能。文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c09724原文引用：DOI: 10.1021/jacs.1c09724
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