分享一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章，题目为“Photo-cross-linking-assisted deorphanization deciphers GPR50–L-LEN pairing in metabolism”。通讯作者共三位，分别为北京脑科学与类脑科学研究所的井淼教授、北京大学化学与分子工程学院的陈鹏教授，以及和中国农业大学的李溱老师。

G蛋白偶联受体（GPCR）是人体内最大的膜蛋白家族，在信号转导和疾病治疗中具有核心地位，但至今仍有约100个GPCR缺乏已知配体（称为孤儿受体），限制了对它们生物学功能的理解和药物开发。传统去孤儿化方法如大规模配体库筛选或组织提取物分馏虽取得一定成功，但存在效率低、所需样本量大、且难以捕获内源性配体等局限。尤其对于低丰度神经肽类配体，其与受体的相互作用瞬时而可逆，在复杂生理环境中更难精准鉴定。光交联技术通过形成共价键稳定蛋白-配体相互作用，为在天然生物样本中直接捕获内源性配体提供了新思路，但如何实现位点特异性交联并避免背景干扰仍是关键挑战。

本研究开发了一种模块化的光交联辅助GPCR去孤儿化平台。团队设计并合成了基于双吖丙啶的光交联剂DiZPK，通过遗传密码扩展技术将其特异性嵌入GPCR的潜在配体结合口袋附近。DiZPK在紫外光照射下生成高反应性卡宾中间体，可与邻近配体形成共价连接。以神经肽Y受体NPY1R及其配体NPY为模型，作者在受体200位天冬氨酸（D200）等位点成功嵌入DiZPK，验证了该平台能高效捕获已知配体（交联效率>80%），且交联反应具有UV依赖性和位点特异性。质谱分析证实交联产物中DiZPK的特征指纹图谱，竞争实验表明NPY1R拮抗剂BMS193885可抑制交联，证明了相互作用特异性。

接下来，作者将该平台应用于孤儿受体GPR50（与代谢和精神疾病相关），通过AlphaFold预测其结构与褪黑素受体同源，选择潜在正交残基位点（如V262、Y280）嵌入DiZPK。利用小鼠下丘脑肽提取物作为配体源，交联产物经免疫沉淀和质谱分析，发现神经肽Little-LEN（L-LEN）为显著富集分子。L-LEN源自前体蛋白ProSAAS，是一种10氨基酸长度的神经肽。体外功能实验显示，L-LEN以纳摩尔级亲和力（EC₅₀ = 47.9 nM）激活GPR50，通过Gαi信号抑制forskolin诱导的cAMP升高，且该效应可被百日咳毒素（Gαi抑制剂）阻断。结合实验表明，FITC标记的L-LEN可特异性结合表达GPR50的细胞，流式细胞术和纳米BRET验证其结合依赖GPR50表达。

进一步通过交联肽组学分析，团队发现L-LEN的C末端区域与GPR50胞外口袋相互作用，点突变实验证实受体中N185、T191、V255等残基对结合至关重要。AlphaFold3模拟预测了L-LEN-GPR50复合物结构，与实验结果高度一致。在原代神经元中，L-LEN通过GPR50特异性抑制自发钙瞬变频率，该效应可被内向整流钾通道阻滞剂tertiapin-Q逆转，提示其通过Gαi-K⁺通道通路调控神经元兴奋性。

体内功能方面，研究团队构建了L-LEN敲除（通过突变前体蛋白C端RR残基阻断酶切）和Gpr50敲除小鼠模型。两者均表现出代谢激素（如TSH、游离T3/T4）水平下降，且在禁食挑战下更易进入蛰伏态（体温显著降低），表型相似支持L-LEN-GPR50信号轴的功能关联。脑室内注射L-LEN可逆转禁食诱导的代谢率下降和体温降低，该效应在Gpr50敲除小鼠中消失，证明GPR50依赖性。机制上，L-LEN通过调控下丘脑-垂体-甲状腺轴（升高血液TSH、T3/T4）和交感神经输出（棕色脂肪UCP1表达增加和去甲肾上腺素水平升高）双重途径促进产热和能量消耗。值得注意的是，L-LEN调控能量代谢但不影响食欲，与其前体B-LEN（通过GPR171调控摄食）功能正交，体现了神经肽加工的功能分化。

此外，该光交联平台具有良好通用性，在线粒体受体5-HT2A（配体：5-羟色胺）和鞘脂受体S1PR1（配体：鞘氨醇-1-磷酸）等模型中也成功实现配体捕获。相比传统方法，该策略无需预知配体结构，可直接从天然样本中鉴定内源性配体，为孤儿受体功能研究提供了强大工具。综上所述，本研究不仅揭示了GPR50-L-LEN信号轴在代谢稳态中的核心作用，还建立了可推广的GPCR去孤儿化新范式，为代谢疾病药物研发提供了新靶点。

本文作者：TZS

责任编辑：WYQ

DOI：10.1038/s41589-025-02098-6

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41589-025-02098-6