近期发表在Biomacromolecules上的“Unimolecular cascaded multienzyme conjugates modulate the microenvironment of diabetic wound to promote healing”。本文的通讯作者是来自福州大学的翁祖铨教授和吴元子教授。
糖尿病是威胁人类健康的最严重慢性疾病之一，晚期糖尿病患者长伴随多种并发症，如难愈合的糖尿病伤口等。造成糖尿病伤口难以愈合的原因有很多，如高血糖环境、细菌感染、氧化应激水平升高、长期慢性炎症以及血管生成不足导致的缺氧等。酶级联疗法是改善糖尿病微环境的常用手段之一，葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase, GOx) 催化过量的葡萄糖氧化降解，超氧化物歧化酶 (superoxidedismutase, SOD) 催化超氧阴离子自由基转化为过氧化氢，过氧化氢酶 (catalase, CAT) 将积聚的过氧化氢转化为氧气以缓解缺氧。因此，酶级联疗法可以减轻糖尿病症状，同时提供多种治疗效果。
如图1所示，本文作者提出了一种“三合一”疗法，将GOx与SOD、CAT模拟物共价结合，构建级联酶偶联物 (cascaded enzyme conjugates, CECs)，用于糖尿病伤口愈合。通过原子转移自由基聚合 (atom-transfer radical polymerization, ATRP)，作者向GOx引入聚(N-丙烯酰赖氨酸) (poly(N-acryloyl-lysine), pLAAm)。pLAAm与亚铁离子配位后将同时表现出SOD、CAT类似催化活性。
图1. CEC通过级联多酶催化促进伤口微环境的恢复，从而改善糖尿病伤口愈合的示意图 CEC的制备步骤如下：1. 高碘酸钠温和氧化GOx上的聚糖，形成GOx-Oxi；2. 引发剂ABM ((2-(Aminooxy)ethyl)2-bromo-2-methylpropanoate) 与GOx-Oxi共价结合，形成大分子引发剂GOx-ABM；3. 蛋白原位引发ATRP，再加入硫酸亚铁与pLAAm配位，形成CEC。如图2所示氧化、修饰ABM对分子量、流体动力学半径、zeta电位或CD谱图没有明显影响。然而，CEC表现出模糊而宽的条带，分子量显著增长。如图2(b, c)所示，CEC的水合半径增加到16-136 nm的宽范围，溶液中有轻微聚集。此外，CEC的zeta电位从GOx的-20.4 mV降低至-36.6 mV，表明CEC在水溶液中具有稳定性。然而，CECs的CD谱图与天然GOx的CD谱图相似，表明温和的化学反应和聚合对二级结构的影响很小。图2. (a) SDS-PAGE; (b) 透射电镜；(c) DLS；(d) Zeta点位；(e) CD谱图 如图3(a, b)所示，温和氧化、聚合后的GOx酶活没有明显下降，CEC的GOx类似酶活仅降低23%。另外，如图3(c-e)所示，CEC表现出明显的SOD、CAT类似酶活，而没有发生显著的芬顿反应。如图3(f)所示，CEC还能显著增加溶液中溶氧量。图3. (a) GOx酶活; (b) GOx酶活动力学曲线；(c) SOD酶活曲线；(d) CAT酶活曲线；(e) 电子自旋共振检测羟基自由基；(f) 溶氧量变化 如图4(a, b)所示，CEC内部存在级联酶促反应，导致葡萄糖消耗速率、葡萄糖酸生成速率 (pH降低速率) 都显著高于同等浓度下GOx。由于GOx消耗了葡萄糖，生成了H2O2，它具有抑菌效果。如图4(c-e)，较高浓度下，CEC和GOx表现出类似的抑菌能力。图4. (a) 葡萄糖消耗曲线; (b) pH变化曲线；(c) CEC对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用；(d) GOx和CEC对大肠杆菌的抑制作用；(e) GOx和CEC对金黄色葡萄球菌的抑制作用 糖尿病小鼠模型中，CEC (D-CEC组) 表现出比商业贴片 (D-CP组)、PBS (D-Con组) 更好的修复效果。如图5(a, b)所示，D-CEC组的伤口修复速度最快。如图5(c)所示，治疗后15天的病理切片中，D-CEC组伤口切片中出现了新的厚表皮，并伴有丰富的肉芽组织。上皮结构完好无损，有新的皮肤组织再生。此外，与其他两组 (D-Con组 和 D-CP组) 相比，D-CEC 组在表皮内表现出更致密的胶原沉积等。这些结果表明，CEC可以加速糖尿病伤口的闭合过程。图5. (a) 不同时间段不同组别伤口的代表性图像；(b) 治疗后第 3、6、9、12 和 15 天不同组别伤口闭合的比例；(c) 治疗 15 天后，伤口切片的 H&E 和 Masson 染色图像 综上所述，作者将GOx经过温和氧化、原位ATRP等步骤转变为具有级联酶功能的CEC偶联物，同时具有GOx、SOD和CAT的功能。CEC能快速降低创面葡萄糖浓度，同时具有抑菌效果，导致它具有良好的促进糖尿病创面愈合的治疗效果。DOI: 10.1021/acs.biomac.3c00698Link: https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.biomac.3c00698
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