发表在Nature Chemical Biology上的文章，通讯作者是来自瑞士洛桑联邦理工学院基础科学学院的Elena A. Goun教授，他们组致力于开发非侵入式生物成像技术来研究癌症和代谢性疾病的分子特征。

      线粒体膜电势ΔΨm对正常的细胞活动十分重要，线粒体功能失调时ΔΨm也会波动，并与众多疾病相关；但是目前在各种病状中ΔΨm的变化是诱因还是结果并没有很清楚的定论。开发对ΔΨm变化的定量评估工具对理解ΔΨm和细胞功能变化之间的关系极为重要。

     此前，研究ΔΨm变化影响的重要问题是缺乏高灵敏度和非侵入性的方法。现有的检测方式均基于线粒体特异性的荧光或离子信号，但是目前最常用的荧光染料探针的高非特异性结合、高背景信号以及会影响线粒体功能的特点限制了其在非透明生物体上的应用。也有一些新型ΔΨm检测探针，它们基于两种在线粒体基质中富集的Click试剂的“Mitoclick”反应，通过MS对产物进行分析定量来反应ΔΨm变化；但是这种方法是侵入性的（需要杀死实验动物），无法用于活体。在本篇文章中，作者发展了一种非侵入性的线粒体激活的荧光素探针MAL，基于线粒体内的click反应并结合高灵敏度生物发光成像技术BLI，能够在非透明活体动物上实现对线粒体ΔΨm变化的评估。

       在探针的设计上，考虑到BLI使用的是被Caged的荧光素（CL），他们决定使用azide-TPP和TPP-CL，由TPP将试剂靶向到线粒体基质中，再通过azide和CL的Staudinger ligation产生荧光素；这些荧光素释放到细胞质后会荧光素酶催化发光，最终可以通过酶标仪或者CCD相机进行体外或体内的检测。他们确定了试剂在线粒体中的富集情况，并发现荧光素的释放量和膜电势的总值相关；这些结果暗示合适的MAL探针可以反映ΔΨm的细小变化。

        他们设计并合成了不同的MAL组合，检测了反应本身的特点、对表达荧光素酶的几种细胞系的影响以及信噪比等，最终他们选择性能较好的MAL3（TPP-CL2、Azido-TPP1）进行ΔΨm监测效果的验证。在体外验证中，他们在细胞中依次加入TPP-CL2和Azido-TPP1并用CCD相机进行检测，使用最常用的TMRM染料作为ΔΨm的对照，在不同ΔΨm影响剂的处理下验证光强和ΔΨm变化的相关性。他们发现光信号和ΔΨm的相关性较好，且有比TMRM更低的检出限及更高的可信度，可以用于超极化时ΔΨm的检测。而在含荧光素酶的小鼠中进行的类似体内实验进一步证明MAL3反应ΔΨm变化的可行性。

       他们随后将这种基于MAL3探针和BLI技术的ΔΨm监测方法在小鼠上进行应用，依次研究了衰老过程、NR（一种维生素B3，已知对能量代谢和神经保护有益，具体机制未明确）饮食和BAT活化时ΔΨm的变化，其结果可以与此前的体外实验对应。此外，他们还在肿瘤小鼠模型上证明MAL3可以反映用药前后肿瘤部位的ΔΨm变化，说明该技术能用于研究肿瘤中异质性线粒体功能或寻找线粒体特异性药物。

     总之，本文作者发展了一种基于MAL探针和高灵敏度BLI技术的线粒体ΔΨm监测方法，该方法能够用于在非透明活体动物上的ΔΨm相关研究。

文章作者：MYZ

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-020-0602-1

原文引用：10.1038/s41589-020-0602-1