推荐一篇发表在Angew上的文章，本文的通讯作者是来自德国威尔茨堡大学的Claudia Höbartner教授。他们实验室的主要研究方向是功能核酸和核酸修饰的化学与化学生物学。

      核苷酸的翻译后修饰对RNA的功能多样性十分重要。目前已知的核苷酸修饰有170多种，但是对这些修饰的检测和定量仍有一定的挑战性。在作者之前的工作中已经成功对m6A修饰的RNA含量进行检测。在此期间，作者发现DNA酶可以加快5-10倍被修饰的RNA的切割速率，而具有更大体积，更强疏水作用的i6A修饰，对脱氧核酶催化的RNA裂解具有更强的激活作用，导致i6A修饰的RNA底物的裂解速度比未修饰的RNA底物快2500倍。m6A和i6A修饰的例子激发了其他RNA修饰的DNA催化剂的研究。

      脱氧核酶能够区分三种天然的单甲基胞嘧啶的异构体分别是m3C，m4C和m5C。并且可以将其与未修饰的胞嘧啶分开。因为这三种修饰对RNA的结构和功能有巨大的影响，所以作者希望通过鉴定修饰特异性的DNA酶，从而可以快速鉴定这三种修饰。

      实验首先进行了gel-based的筛选试验，将m3C，m4C和m5C的筛选分别命名为AL，AM和AN。筛选的DNA文库是N20，底物为三种合成的RNA，他们之中带有三种单甲基胞嘧啶的其中一个。阴性筛选阶段加入了没有修饰的RNA，所以同时切割未修饰和修饰的DNA酶就被排除了。同时该实验也筛选出了更偏向于切割未修饰RNA的DNA酶（AK）。接着利用等摩尔的混合又进行了第二到第四轮的筛选。作者接着在RNA底物上加入了一个简并的核苷酸筛选了可以同时切割四种二核苷酸序列的motif。

      完成了18轮筛选后，对富集到的DNA池进行克隆，其中有10个克隆被选择。为了进一步确定符合要求的DNAzyme，作者用NGS对AK,AL,AM以及AN的候选池进行了深度分析。通过筛选，有45个DNA序列进行了独立的RNA荧光底物的验证。随后利用RNase T1和碱性水解酶的ladders，作者确定了每个活性DNA酶的裂解位点。最终通过实验，AL112,AM101和AN05为Um3C- Um4C- Um5C-的RNA底物的最优切割酶，而AK104可以有效地切割未修饰的序列，并且可以被任何一种修饰的RNA抑制。所以最终作者就用这套脱氧核酶进行下一步的验证。

      作者接着用质谱法验证了这四种被选定的催化剂的裂解产物，切割效率，切割位点以及预测了切割位点对反应机理的影响。同时研究了在三种异构体都存在的情况下是否还能有效地切割。作者在混合物中分别对四种胞嘧啶进行了不同的荧光标记，然后与AL112,AM101或AN05的脱氧核酶进行孵育，与预期的一致，每个DNAzyme对其目标修饰的特异性都很好，因此这些脱氧核酶可以有效地检测混合物中甲基胞嘧啶的类别。

   实验的最后，作者在人类的mt-tRNA^Glu等复杂的长RNA底物上进行了检验，实验同样证明了这套DNA酶的可靠性。

      总之，本篇文章报道了一套可以用于区分三种天然甲基胞嘧啶的RNA-切割脱氧核酶。

文章作者：WYK

责任编辑：Guo ZH

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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202106517

原文引用：DOI：10.1002/anie.202106517