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发表在Nature Communications上的文章——“Metabolic tagging of extracellular vesicles and development of enhanced extracellular vesicle based cancer vaccines”。该文章的通讯作者是来自伊利诺伊大学香槟分校材料科学与工程系的王华助理教授，王华博士团队主要基于化学生物学工具，进行生物医用高分子材料、肿瘤靶向、癌症免疫治疗、细胞糖代谢等方向的研究。在本研究中，作者借助代谢标记技术和生物正交反应，在细胞外囊泡（EVs）上引入Toll样受体激动剂，用于激活树突状细胞以产生优异的抗肿瘤 CD8+ T细胞反应，进一步用于癌症治疗。
EVs是由细胞分泌的一种能够携带多种生物分子的小囊泡，在细胞间通讯中发挥重要作用，具有巨大的疾病诊疗开发潜力。肿瘤EVs可以被抗原呈递细胞（例如DC）内吞，随后由DC处理和呈递包裹的抗原，引发抗肿瘤细胞毒性 T 淋巴细胞反应（CTL反应）。肿瘤 EVs被认为是比传统使用的死亡肿瘤细胞或肿瘤裂解物更安全的肿瘤抗原来源。然而，目前在功能化EVs及调节EVs与接受细胞之间的相互作用方面存在挑战，因此需要开发新的技术来解决这些问题。 为了开发一种新的标记技术以实现对EV的追踪和功能化，本文作者对亲本细胞（例如癌细胞、干细胞、免疫细胞）进行代谢聚糖标记，从而在细胞分泌的EV上引入叠氮基团，然后通过生物正交反应进一步引入可检测的标签或感兴趣的分子（图1a）。进一步地，作者试图通过此方法在肿瘤EV上缀合TLR9 激动剂，TLR9 激动剂缀合的 EVs 可以通过 TLR9 内体被 DC 内化，并及时刺激DC，实现增强CTL反应和抗肿瘤功效（图1b）。 图1. 细胞外囊泡的代谢标记及肿瘤疫苗的制备
首先，作者先确认能否通过代谢聚糖标记来标记细胞和EVs。共聚焦荧光成像和流式细胞术等结果证明，通过非天然糖单体Ac4ManNAz的代谢聚糖标记可成功在多种细胞类型（如癌细胞、间充质干细胞、免疫细胞）的细胞表面及生成的EVs上标记叠氮基团。透射电子显微镜、动态光散射和纳米颗粒跟踪系统测定显示上述标记基本不影响EVs的表观性状（图2）。
图2. 癌细胞及其EVs的代谢聚糖标记
接下来，作者通过代谢标记实现肿瘤 EVs 的分离及体内外示踪。作者将Ac4ManNAz处理的癌细胞的 EVs与DBCO-生物素反应，并利用链霉亲和素微珠成功捕获生物素标记的EVs，捕获的EVs进一步在二硫苏糖醇（DTT）处理下，以较高的回收率从微珠上被完整释放。荧光成像和流式细胞分析等结果显示，这些分离的带有叠氮标签的EVs，被荧光标记后，可观察到被骨髓来源DC细胞摄取以及在活体小鼠内淋巴结位置的富集（图3）。
图3. 肿瘤 EVs 的标记、分离及体内外跟踪
接下来，作者将TLR9 激动剂（如CpG）与 EVs偶联，发现其具有优异的DC激活效果，并进一步了改善DC的抗原呈递能力，增强其CTL反应（图4）。
图4. TLR9激动剂缀合的肿瘤EVs增强DC的抗原呈递能力和CTL反应 最后，作者在体内验证了TLR9 激动剂缀合的肿瘤 EVs 对肿瘤的治疗效果。对携带E.G7-OVA 淋巴瘤和 B16F10 黑色素瘤的小鼠施用CpG缀合的肿瘤衍生EVs、CpG和EVs的混合物或单独的EVs，用抗 PD-1 或 EVs 和抗 PD-1 联合治疗的小鼠作为对照。和其他组相比，CpG缀合的肿瘤衍生的EVs能显著抑制肿瘤生长，延长动物存活期，增强抗肿瘤功效，对脾肝肾肺心等其他组织也没有表现出任何明显的毒性（图5）。
图5. 图4. TLR9激动剂缀合的肿瘤EVs显现出增强的肿瘤疗效
综上所述，作者提出的代谢标记EVs策略可用于来源于多种细胞类型EVs的标记、分离、示踪，并且TLR9激动剂缀合的肿瘤细胞来源EVs可显著提高树突状细胞的激活，提高CTL反应，增强肿瘤治疗效果。这一发现对于开发基于EVs的癌症疫苗具有重要意义，并有望在未来的癌症治疗中发挥重要作用。 文章作者：TX 原文链接： https://doi.org/10.1038/s41467-023-43914-8 责任编辑：LD
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